免疫沉淀技術(shù)說課講解

1、免疫沉淀技術(shù)免疫沉淀技術(shù) 免疫沉淀反應(yīng)定義 免疫化學(xué)基礎(chǔ) 免疫沉淀技術(shù)分類 免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用沉淀反應(yīng)原理沉淀原（precipitinogen）沉淀素（precipitin）抗原抗體間的力疏水性的改變電荷的改變分子量及結(jié)構(gòu)的改變沉淀的發(fā)生抗原的價(jià)抗體的價(jià)IgG、IgA、IgD和IgE類抗體： 兩價(jià)分泌型IgA：四價(jià)IgM類抗體：十價(jià)親和力和親合力 affinityavidity抗原抗體反應(yīng)的特異性特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)epitope交叉反應(yīng)交叉反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)1. 抗原異質(zhì)性抗原異質(zhì)性（antigen heterogeneity）2. 共同抗原決定簇共同抗原決定簇 （common antigenic

2、determinant）3. 決定簇相似決定簇相似 共同抗原的類型 1. 同種抗原2. 嗜異性抗原（又稱Forssman抗原） 抗原抗體反應(yīng)的最適比例抗原抗體反應(yīng)的階段性 抗原抗體結(jié)合階段2. 抗原抗體反應(yīng)階段 抗原抗體反應(yīng)的影響因素1中性鹽的作用 2pH 3溫度4離子強(qiáng)度中性鹽的作用 加入高濃度鹽（如硫酸銨）以脫水，或者用分子量大約6000，濃度34%聚乙二醇（PEG6000），以其多聚物孔隙排阻脫水來大大降低抗原抗體復(fù)合物的溶解度。 pH值 盡可能調(diào)節(jié)pH至復(fù)合物的等電點(diǎn)附近，通常此pH值是介于IgG等電點(diǎn)（約pH=7）和抗原等電點(diǎn)之間，也依賴于抗原與抗體的比例。溫度溫度與抗原抗體反應(yīng)有密

3、切的關(guān)系 溫度升高可促使分子運(yùn)動(dòng)加快，抗原與抗體碰撞機(jī)會(huì)多，容易結(jié)合，但也容易再解離; 溫度低，分子運(yùn)動(dòng)慢，撞擊機(jī)會(huì)少，但一旦結(jié)合后則不易再分開。離子強(qiáng)度（1）有利于抗原抗體結(jié)合的條件： 中等或較低離子強(qiáng)度（2）有利于抗原抗體解離的條件： 高離子強(qiáng)度 免疫沉淀技術(shù) 免疫沉淀反應(yīng)定義 免疫化學(xué)基礎(chǔ) 免疫沉淀技術(shù)分類 免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用沉淀反應(yīng)的種類 1溶液中沉淀反應(yīng) 2凝膠中沉淀反應(yīng) 溶液中沉淀反應(yīng) 是指在清徹透明的液體中，呈溶解狀態(tài)的抗原與抗體在試管內(nèi)或凹玻片上混勻，可凝聚成為肉眼可見的絮狀或顆粒狀的不溶性沉淀物。絮狀沉淀試驗(yàn)康氏反應(yīng)（Kahns test）:心肌提取的類脂質(zhì)抗原+反應(yīng)素（Ae

4、gagin）敏感性高，特異性差，易出現(xiàn)假陽性。(1991年首批淘汰)性病研究實(shí)驗(yàn)室法(venereal disease research laboratory，VDRL)心擬脂及卵磷酯+反應(yīng)素（Aegagin）不需加熱的血清反應(yīng)素試驗(yàn)(unheated serum reagin)心擬脂及卵磷酯+氯化膽堿+反應(yīng)素（Aegagin）反應(yīng)最適比測(cè)定（1）抗原稀釋法（Dean-Webb法）（2）抗體稀釋法（Ramon法）（3）方陣法或棋盤格滴定法（checkerboard titration）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（ring precipitation test）Ascoli于1902年建立用于檢查獸類內(nèi)臟、毛

5、皮浸液等標(biāo)本中的炭疽桿菌抗原免疫比濁法（immunoturbidimetry）優(yōu)點(diǎn)：校正曲線穩(wěn)定，簡(jiǎn)便快速，易于自動(dòng)化，無放射性核素污染缺點(diǎn)：特異性、靈敏度稍差免疫比濁法的分類（1）透射比濁法（transmission turbidimetry）（2）散射比濁法（nephelometry）（3）免疫膠乳濁度測(cè)定法（immunolatex turbidimetry）（4）速率抑制免疫比濁法（rate inhibition immunoturbidimetry）免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation assay）關(guān)鍵因素抗原的豐度抗體的結(jié)合能力蛋白和抗體的可接觸性應(yīng)用范圍免疫共沉淀技

6、術(shù)（Co-Immunoprecipitation assay）結(jié)果分析Nat Immunol. 2008 Apr;9(4):369-77. GST PULL DOWN結(jié)果分析PNAS February 26, 2008 vol. 105 no. 8 2836-2841 應(yīng)用范圍尋找新的相互作用蛋白驗(yàn)證目的蛋白和待測(cè)蛋白是否有相互作用免疫共沉淀的局限性（1）難以檢測(cè)低親和力和短暫的相互作用（2）不能夠確切分辨第三種蛋白的橋聯(lián)作用（3）靈敏度不如親和色譜高（4）需對(duì)未知蛋白的相關(guān)信息有一定了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控染色質(zhì)免疫共沉淀染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果分析Mol Cancer Ther June 2010 v

7、ol. 9 no. 6 1764-1774 RNA免疫沉淀 在生理狀態(tài)下對(duì)結(jié)合在RNA上的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀，然后通過基因芯片或者其它手段檢測(cè)目的RNA的含量。應(yīng)用范圍研究蛋白與DNA的動(dòng)態(tài)作用研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系研究蛋白與RNA的相互作用 免疫沉淀中抗體的選擇免疫共沉淀技術(shù)的應(yīng)用凝膠中沉淀反應(yīng) 以一定濃度（12%）的瓊脂（或瓊脂糖）凝膠作為介質(zhì)，將抗原、抗體溶液分別放在瓊脂凝膠板上并使它們彼此在凝膠中自由擴(kuò)散，形成濃度梯度，當(dāng)抗原與抗體相遇且比例適當(dāng)時(shí)，在相應(yīng)位置即可出現(xiàn)可見的沉淀環(huán)或沉淀線。沉淀線特點(diǎn)形成沉淀線的特異性抗原抗體無法通過沉淀線，只能在沉淀線周圍形成沉淀

8、與沉淀線無關(guān)的抗原和抗體分子則可以自由通過沉淀線的位置與抗原抗體的濃度和遷移率有直接關(guān)系單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（single immunodiffusion）雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（double immunodiffusion）沉淀線分析A B C D E F AgAb沉淀線分析免疫電泳（immunoelectrophoresis）對(duì)流免疫電泳（counter immunoelectrophoresis）火箭免疫電泳（rocket immunoelectrophoresis）交叉免疫電泳（crossed immunoelectrophoresis）免疫固定電泳（immunofixation electro

9、phoresis） 首先將蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行電泳分離，電泳后直接將抗體加于蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，抗體與對(duì)應(yīng)的抗原就會(huì)直接結(jié)合，形成的復(fù)合物嵌于固相支持物中。Urine Immunofixation Electrophoresis免疫印跡技術(shù)（immunoblotting）基本流程一 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）1. 收集蛋白樣品：貼壁細(xì)胞、組織、藥物處理細(xì)胞2. 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：BCA3. 電泳：10分離膠、4的濃縮膠4. 電泳結(jié)果檢查二. 電轉(zhuǎn)移毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法轉(zhuǎn)移膜的選擇NC膜尼龍膜PVDF膜靈敏度和分辨率高高高背景低較高低結(jié)合能力80110ug/cm2400ug/cm2125200ug/cm2（適合于SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）材料質(zhì)地干的NC膜易脆軟而結(jié)實(shí)機(jī)械強(qiáng)度高溶劑耐受性無無有操作程序緩沖液潤濕,避免氣泡緩沖液潤濕100%甲醇潤濕檢測(cè)方式常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測(cè)不能用陰離子染料常規(guī)染色，比較于NC膜，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于ECL檢測(cè)，快速免疫檢測(cè)適用范圍0.45um一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低濃度小分子蛋白、酸性蛋