第九章 動(dòng)物細(xì)胞融合

1、第九章第九章 動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合第一節(jié)第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞融合的概念動(dòng)物細(xì)胞融合的概念 1919世紀(jì)世紀(jì)3030年代，人們相繼在肺結(jié)核、天年代，人們相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理組織中花、水痘、麻疹等疾病患者的病理組織中觀(guān)察到觀(guān)察到多核細(xì)胞多核細(xì)胞，1919世紀(jì)世紀(jì)7070年代，在蛙的年代，在蛙的血細(xì)胞中也看到了多核細(xì)胞的現(xiàn)象，但由血細(xì)胞中也看到了多核細(xì)胞的現(xiàn)象，但由于受當(dāng)時(shí)對(duì)生物學(xué)認(rèn)識(shí)水平的限制，人們于受當(dāng)時(shí)對(duì)生物學(xué)認(rèn)識(shí)水平的限制，人們對(duì)這一現(xiàn)象并沒(méi)有給予足夠的重視。對(duì)這一現(xiàn)象并沒(méi)有給予足夠的重視。19571957年，日本科學(xué)家崗田善雄在培養(yǎng)動(dòng)年，日本科學(xué)家崗田善雄在培養(yǎng)動(dòng)

2、物細(xì)胞時(shí)加入失去活性的物細(xì)胞時(shí)加入失去活性的仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒，發(fā)，發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞融合、產(chǎn)生具有兩個(gè)核的細(xì)胞。現(xiàn)了細(xì)胞融合、產(chǎn)生具有兩個(gè)核的細(xì)胞。 后來(lái)人們用此方法又成功地誘導(dǎo)了不同后來(lái)人們用此方法又成功地誘導(dǎo)了不同種動(dòng)物的體細(xì)胞融合，并且能將雜種細(xì)種動(dòng)物的體細(xì)胞融合，并且能將雜種細(xì)胞培養(yǎng)成活，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)隨之誕胞培養(yǎng)成活，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)隨之誕生?，F(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生?，F(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)等多種學(xué)學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)等多種學(xué)科的研究工作中。科的研究工作中。細(xì)胞細(xì)胞A細(xì)胞細(xì)胞B雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞滅活的病毒滅活的病毒物理法物理法化學(xué)法化學(xué)法仙臺(tái)病

3、毒仙臺(tái)病毒皰疹病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒新城雞瘟病毒 概念：概念：通過(guò)誘導(dǎo)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或通過(guò)誘導(dǎo)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞融合（多核細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞融合（cell fusion）。如果）。如果2個(gè)不同的細(xì)胞進(jìn)行融合，則稱(chēng)為細(xì)胞雜交（個(gè)不同的細(xì)胞進(jìn)行融合，則稱(chēng)為細(xì)胞雜交（cell hybridization）融合細(xì)胞的類(lèi)型：融合細(xì)胞的類(lèi)型：同核體（同核體（homokaryon）：由同一生物：由同一生物個(gè)體的細(xì)胞（基因型相同）所融合形成個(gè)體的細(xì)胞（基因型相同）所融合形成的融合細(xì)胞。的融合細(xì)胞。異核體（異核體（heterokaryon）：）：來(lái)自不同基來(lái)自不

4、同基因型的細(xì)胞所融合形成的雜交細(xì)胞。因型的細(xì)胞所融合形成的雜交細(xì)胞。1.生物方法（病毒）生物方法（病毒） 病毒是最早采用的融合劑。某些病毒被膜中有病毒是最早采用的融合劑。某些病毒被膜中有融合蛋白融合蛋白（fusion protein），），可介導(dǎo)病毒同宿可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合，也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。主細(xì)胞融合，也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。 常用于誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的病毒有仙臺(tái)病毒、常用于誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的病毒有仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等。用作融合劑的病新城雞瘟病毒、皰疹病毒等。用作融合劑的病毒必須事先毒必須事先滅活滅活（紫外線(xiàn)或（紫外線(xiàn)或-丙內(nèi)酯），使病毒丙內(nèi)酯），使病毒的感染活性喪

5、失而保留病毒的融合活性。的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。 第二節(jié)第二節(jié) 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 仙臺(tái)病毒是最常用的病毒誘導(dǎo)融合劑。仙臺(tái)病毒是最常用的病毒誘導(dǎo)融合劑。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：融合率較高、應(yīng)用廣（對(duì)各種動(dòng)融合率較高、應(yīng)用廣（對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞都適宜）、容易培養(yǎng)（可在雞胚物細(xì)胞都適宜）、容易培養(yǎng)（可在雞胚中大量繁殖）。中大量繁殖）。病毒介導(dǎo)融合的缺點(diǎn)：病毒介導(dǎo)融合的缺點(diǎn)： 不穩(wěn)定，在保存過(guò)程中融合活性會(huì)降不穩(wěn)定，在保存過(guò)程中融合活性會(huì)降低；制備過(guò)程比較煩瑣。此外，病毒引低；制備過(guò)程比較煩瑣。此外，病毒引

6、進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾。生干擾。2. 2. 化學(xué)誘導(dǎo)融合化學(xué)誘導(dǎo)融合 化學(xué)融合劑主要有高級(jí)脂肪酸衍生物、脂化學(xué)融合劑主要有高級(jí)脂肪酸衍生物、脂質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質(zhì)和多肽，性蛋白質(zhì)和多肽，其中最常用的是聚乙二醇其中最常用的是聚乙二醇（PEGPEG）。）。 PEGPEG可以促使細(xì)胞凝結(jié)、破壞互相接觸處可以促使細(xì)胞凝結(jié)、破壞互相接觸處的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸的細(xì)胞膜之間發(fā)生融合，進(jìn)而細(xì)胞質(zhì)溝通，的細(xì)胞膜之間發(fā)生融合，進(jìn)而細(xì)胞質(zhì)溝通，形

7、成一個(gè)大的雙核或多核融合細(xì)胞。形成一個(gè)大的雙核或多核融合細(xì)胞。 影響影響PEGPEG誘導(dǎo)融合效果的因素：誘導(dǎo)融合效果的因素：1. 分子量與濃度：分子大、濃度高的分子量與濃度：分子大、濃度高的PEG，有利于融合，但毒性也隨之增大。一般用有利于融合，但毒性也隨之增大。一般用分子量分子量PEG 1000-4000 ，40%-60%2. PH:8.0-8.23. 誘導(dǎo)時(shí)間：長(zhǎng)，效率高，但毒性增大、容誘導(dǎo)時(shí)間：長(zhǎng)，效率高，但毒性增大、容易形成多核細(xì)胞易形成多核細(xì)胞4. 溫度：溫度：38-40度度 3. 3.物理方法物理方法( (離心，震動(dòng)，電融合離心，震動(dòng)，電融合) ) 最常用的是電融合法最常用的是電融

8、合法 細(xì)胞在電場(chǎng)中排列成串、聚集成串珠狀，細(xì)胞在電場(chǎng)中排列成串、聚集成串珠狀，然后施加高壓電脈沖，促使細(xì)胞在相互接觸的然后施加高壓電脈沖，促使細(xì)胞在相互接觸的細(xì)胞膜處產(chǎn)生穿孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連細(xì)胞膜處產(chǎn)生穿孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞融合。通，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞融合。 細(xì)胞電融合技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)，如細(xì)胞電融合技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)，如誘導(dǎo)細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率高，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，操作簡(jiǎn)便，融合的頻率高，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性好。可重復(fù)性好。 兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類(lèi)型細(xì)胞，如：類(lèi)型細(xì)胞，如： 1) 1) 親本細(xì)胞親本細(xì)胞 2

9、) 2) 同核體：同源細(xì)胞的融合體同核體：同源細(xì)胞的融合體 3) 3) 異核體：非同源的細(xì)胞的融合體異核體：非同源的細(xì)胞的融合體 4) 4) 多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體的融合體 篩選的目的是為了獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞篩選的目的是為了獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞第三節(jié)第三節(jié) 雜種細(xì)胞的篩選雜種細(xì)胞的篩選融合細(xì)胞的篩選方法融合細(xì)胞的篩選方法1. 1. 利用細(xì)胞形態(tài)、大小、顏色差異篩選利用細(xì)胞形態(tài)、大小、顏色差異篩選2. 2. 利用抗藥性篩選利用抗藥性篩選 親本親本A A：對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡那霉素不對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡那霉素不敏感敏感 親本親本B B：對(duì)卡那霉素敏感

10、，對(duì)氨芐青霉素不對(duì)卡那霉素敏感，對(duì)氨芐青霉素不敏感敏感 雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)上生長(zhǎng) 3. 3. 利用營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選：利用營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選：細(xì)胞在缺乏一種細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖，即或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖，即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營(yíng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。 親本親本A A：色氨酸缺陷型色氨酸缺陷型 親本親本B B：蘇氨酸缺陷型蘇氨酸缺陷型 雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死

11、亡。的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。4. 利用基因缺陷互補(bǔ)篩選利用基因缺陷互補(bǔ)篩選 最常用的是在親本細(xì)胞的嘧啶和嘌呤代謝最常用的是在親本細(xì)胞的嘧啶和嘌呤代謝途徑中引入途徑中引入缺陷突變?nèi)毕萃蛔儊?lái)篩選雜交細(xì)胞，即來(lái)篩選雜交細(xì)胞，即HAT篩選系統(tǒng)。篩選系統(tǒng)。 細(xì)胞合成核苷酸有細(xì)胞合成核苷酸有2條途徑：從頭合成途徑和條途徑：從頭合成途徑和補(bǔ)救途徑。補(bǔ)救途徑。 阻斷從頭合成核苷酸阻斷從頭合成核苷酸途徑的物質(zhì)：途徑的物質(zhì)：次黃嘌呤次黃嘌呤(hypoxantin，H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminopterin，A)和胸和胸腺嘧啶脫氧核苷腺嘧啶脫氧核苷(thymidin，T)。HAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：含

12、有含有H、A、T的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基 在在HATHAT培養(yǎng)基上，細(xì)胞從頭合成培養(yǎng)基上，細(xì)胞從頭合成核苷酸核苷酸途途徑被阻斷，只能利用補(bǔ)救合成途徑。徑被阻斷，只能利用補(bǔ)救合成途徑。 在補(bǔ)救途徑中，次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖在補(bǔ)救途徑中，次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)HGPRTHGPRT）和胸苷酸激酶）和胸苷酸激酶（TKTK）起起重要作用。重要作用。 HGPRTHGPRT- -和和TKTK- -的細(xì)胞不能增殖，的細(xì)胞不能增殖，但但HGPRTHGPRT- - -TKTK+ +與與HGPRTHGPRT+ +-TK-TK- -融合細(xì)胞融合細(xì)胞則可以增殖。則可以增殖。鼠人XTK-HGPRT+TK+

13、HGPRT-鼠人鼠人鼠 人TK+和HGPRT+HATHATHAT不分裂不分裂分裂HAT篩選示意圖第四節(jié)第四節(jié) 融合細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)融合細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 篩選出來(lái)的融合細(xì)胞仍屬于異質(zhì)性的篩選出來(lái)的融合細(xì)胞仍屬于異質(zhì)性的細(xì)胞群，不完全是純系，需要進(jìn)一步純細(xì)胞群，不完全是純系，需要進(jìn)一步純化、獲得同質(zhì)性的細(xì)胞群。常用方法是化、獲得同質(zhì)性的細(xì)胞群。常用方法是克隆化培養(yǎng)。克隆化培養(yǎng)?？寺』囵B(yǎng)：克隆化培養(yǎng)：培養(yǎng)單個(gè)雜交細(xì)胞、以得培養(yǎng)單個(gè)雜交細(xì)胞、以得到遺傳特征相同而穩(wěn)定的雜種細(xì)胞系。到遺傳特征相同而穩(wěn)定的雜種細(xì)胞系。 1.1.半固體培養(yǎng)法半固體培養(yǎng)法= =平板培養(yǎng)平板培養(yǎng) 單細(xì)胞在軟瓊脂（或者瓊脂糖）培

14、養(yǎng)單細(xì)胞在軟瓊脂（或者瓊脂糖）培養(yǎng)基上增殖后不能移動(dòng)，形成集落。待細(xì)基上增殖后不能移動(dòng)，形成集落。待細(xì)胞集落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)后，用吸管從瓊脂胞集落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)后，用吸管從瓊脂上挑出來(lái)上挑出來(lái)( (一般一般8-108-10天后天后) )，再移到液體，再移到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行繁殖。培養(yǎng)基中，進(jìn)行繁殖。2. 2. 有限稀釋法有限稀釋法 將細(xì)胞稀釋到將細(xì)胞稀釋到100100個(gè)個(gè)/ml/ml，理論上每，理論上每0.01ml(100.01ml(10l) )含有含有1 1個(gè)細(xì)胞。取個(gè)細(xì)胞。取0.01ml0.01ml細(xì)胞液在培養(yǎng)板細(xì)胞液在培養(yǎng)板( (如如9696孔板孔板) )的小孔中培養(yǎng)，則可獲得單個(gè)細(xì)胞形成的集

15、落。的小孔中培養(yǎng)，則可獲得單個(gè)細(xì)胞形成的集落。1) 1) 取取1.0 ml 51.0 ml 510104 4/ml/ml細(xì)胞細(xì)胞+4ml+4ml培養(yǎng)基稀釋?zhuān)门囵B(yǎng)基稀釋?zhuān)?1 110104 4/ml./ml.2) 2) 取取0.5ml 10.5ml 110104 4/ml/ml細(xì)胞液細(xì)胞液+4.5ml+4.5ml培養(yǎng)基稀釋?zhuān)囵B(yǎng)基稀釋?zhuān)?得得1 110103 3/ml./ml.3) 3) 取取0.5ml10.5ml110103 3/ml/ml細(xì)胞液細(xì)胞液+4.5ml+4.5ml培養(yǎng)基稀釋?zhuān)门囵B(yǎng)基稀釋?zhuān)?00 cells/ml.100 cells/ml.4) 4) 取取0.01ml0.01

16、ml的的 100 cells/ml100 cells/ml細(xì)胞液于培養(yǎng)板小孔，細(xì)胞液于培養(yǎng)板小孔，加加0.1 ml0.1 ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得雜種細(xì)胞系。培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得雜種細(xì)胞系。3. 3. 顯微鏡操作法顯微鏡操作法 通過(guò)顯微操作分離雜交單細(xì)胞、分別單獨(dú)培養(yǎng)。通過(guò)顯微操作分離雜交單細(xì)胞、分別單獨(dú)培養(yǎng)。4. 4. 蓋片分離法蓋片分離法1) 1) 用釘錘于潔凈的橡膠上砸干凈蓋玻片；用釘錘于潔凈的橡膠上砸干凈蓋玻片；2) 2) 選擇碎塊、大小形態(tài)適用碎片；選擇碎塊、大小形態(tài)適用碎片；3) 3) 加培養(yǎng)液、進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；加培養(yǎng)液、進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；4) 4) 倒置鏡下選細(xì)胞，挑出單細(xì)胞玻片；倒置鏡下選細(xì)

17、胞，挑出單細(xì)胞玻片；5) 5) 進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。5. 5. 熒光激活分離法熒光激活分離法 用一種熒光激活細(xì)胞分類(lèi)器（用一種熒光激活細(xì)胞分類(lèi)器（Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS）分離雜交細(xì)胞。）分離雜交細(xì)胞。 原理：將細(xì)胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個(gè)原理：將細(xì)胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個(gè)細(xì)胞的線(xiàn)形液滴，在激發(fā)光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒細(xì)胞的線(xiàn)形液滴，在激發(fā)光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號(hào)由光電倍增管接收，再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)大小光，此信號(hào)由光電倍增管接收，再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號(hào)，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號(hào)并與預(yù)定的產(chǎn)生光散

18、射信號(hào)，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號(hào)并與預(yù)定的信號(hào)對(duì)比，根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及細(xì)胞大小不同，將細(xì)信號(hào)對(duì)比，根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及細(xì)胞大小不同，將細(xì)胞分成不同級(jí)別，在電場(chǎng)中發(fā)生偏離，而分別收集于胞分成不同級(jí)別，在電場(chǎng)中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。不同容器中。第五節(jié)第五節(jié) 細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用 動(dòng)物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體，抑制抗原的作用；動(dòng)物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體，抑制抗原的作用；增加身體的抗體就可以提高機(jī)體的抗病能力。增加身體的抗體就可以提高機(jī)體的抗病能力。 抗體具有特異性，其特異性取決于抗原分子的決定抗體具有特異性，其特異性取決于抗原分子的決定簇。簇。 抗原決定簇：抗原決定簇：存在于

19、抗原分子中決定抗原特異性的存在于抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，一般由特殊化學(xué)基團(tuán)，一般由58個(gè)氨基酸或單糖或核苷酸個(gè)氨基酸或單糖或核苷酸殘基組成。殘基組成。一、一、B B淋巴細(xì)胞雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體淋巴細(xì)胞雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體 各種抗原分子具有很多抗原決定簇，不同抗原的各種抗原分子具有很多抗原決定簇，不同抗原的決定簇?cái)?shù)目不同，如白喉類(lèi)毒素有決定簇?cái)?shù)目不同，如白喉類(lèi)毒素有8 8個(gè)，流感病毒有個(gè)，流感病毒有4040多個(gè)。抗原決定簇大多存在于抗原的表面，但也多個(gè)?？乖瓫Q定簇大多存在于抗原的表面，但也有隱藏在抗原內(nèi)部。有隱藏在抗原內(nèi)部。 抗體是由抗體是由B B淋巴細(xì)胞分化形成的漿細(xì)胞合成、分

20、淋巴細(xì)胞分化形成的漿細(xì)胞合成、分泌的。泌的。每一個(gè)每一個(gè)B B淋巴細(xì)胞在成熟的過(guò)程中只產(chǎn)生一種淋巴細(xì)胞在成熟的過(guò)程中只產(chǎn)生一種抗體。動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的抗體。動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的B B淋巴細(xì)胞，因此，淋巴細(xì)胞，因此，當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，每種當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，每種B B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體（單一抗體），整個(gè)動(dòng)物可以產(chǎn)生眾多不同的抗體（單一抗體），整個(gè)動(dòng)物可以產(chǎn)生眾多不同的抗體（多克隆抗體）。（多克隆抗體）。用免疫動(dòng)物生產(chǎn)、制備抗體效率用免疫動(dòng)物生產(chǎn)、制備抗體效率低，且多克隆抗體應(yīng)用有很多缺陷，分離這些不同低，且多克隆抗體應(yīng)用有很多缺陷，分離這些不同的抗體極為困難。的

21、抗體極為困難。 選出一個(gè)合成一種專(zhuān)一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可選出一個(gè)合成一種專(zhuān)一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)增殖而形成的細(xì)胞群，即得到由單細(xì)胞經(jīng)增殖而形成的細(xì)胞群，即單克隆細(xì)胞單克隆細(xì)胞。單克隆細(xì)胞合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱(chēng)為單克隆細(xì)胞合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱(chēng)為單單克隆抗體克隆抗體。單克隆抗體具有理化性狀高度均一、生物單克隆抗體具有理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合特異性強(qiáng)、質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)活性單一、與抗原結(jié)合特異性強(qiáng)、質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)，用途：用途：1 1醫(yī)學(xué)診斷試劑醫(yī)學(xué)診斷試劑 廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫、放射免疫分析、免疫組化和廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫、放射免疫分析、免疫組化

22、和流式細(xì)胞儀等技術(shù)。單克隆抗體促進(jìn)了流式細(xì)胞儀等技術(shù)。單克隆抗體促進(jìn)了商品化試劑盒商品化試劑盒的發(fā)展，試劑盒靈敏度高、使用方便、快速，用于的發(fā)展，試劑盒靈敏度高、使用方便、快速，用于病病原微生物抗原、腫瘤抗原、免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)，原微生物抗原、腫瘤抗原、免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)，激素、細(xì)胞因子的測(cè)定。激素、細(xì)胞因子的測(cè)定。2. 2. 食品安全的檢測(cè)食品安全的檢測(cè) 食品中的毒素（如黃曲霉毒素）、有機(jī)農(nóng)藥的檢測(cè)。食品中的毒素（如黃曲霉毒素）、有機(jī)農(nóng)藥的檢測(cè)。方便、靈敏方便、靈敏3蛋白質(zhì)的提純蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在

23、一個(gè)惰性的固相基質(zhì)（如抗體吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性時(shí)，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，欲分離的抗原與抗體解，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。4 4 腫瘤的導(dǎo)向治療（生物導(dǎo)彈）腫瘤的導(dǎo)向治療（生物導(dǎo)彈） 化療、放療：無(wú)選

24、擇性，副作用大化療、放療：無(wú)選擇性，副作用大 把腫瘤單克隆抗體與抗癌藥物結(jié)合起來(lái)，把腫瘤單克隆抗體與抗癌藥物結(jié)合起來(lái)，就成為就成為 “ “生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”。把這種抗體。把這種抗體“導(dǎo)彈導(dǎo)彈”注射到癌癥患者的血液中，它就會(huì)在患者體注射到癌癥患者的血液中，它就會(huì)在患者體內(nèi)追蹤并附著于癌細(xì)胞上，然后與抗體結(jié)合內(nèi)追蹤并附著于癌細(xì)胞上，然后與抗體結(jié)合的抗癌藥物殺傷和破壞癌細(xì)胞，而且很少損的抗癌藥物殺傷和破壞癌細(xì)胞，而且很少損傷正常組織細(xì)胞。這種抗體傷正常組織細(xì)胞。這種抗體“導(dǎo)彈導(dǎo)彈”具有高具有高度選擇性，對(duì)癌細(xì)胞命中率高、殺傷力強(qiáng)大、度選擇性，對(duì)癌細(xì)胞命中率高、殺傷力強(qiáng)大、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。副作用小等優(yōu)

25、點(diǎn)。 動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)為單克隆抗體的制備提供了個(gè)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)為單克隆抗體的制備提供了個(gè)全新、高效的方法。全新、高效的方法。 1975年，年，G. Kohler（德國(guó)）和（德國(guó)）和C. Milstein（阿根廷、（阿根廷、英國(guó)雙國(guó)籍）把產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞英國(guó)雙國(guó)籍）把產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成進(jìn)行融合，形成雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞，證明了這種細(xì)胞既有，證明了這種細(xì)胞既有骨骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限增殖髓瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的能力，又有的能力，又有淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。因此，這種雜交瘤細(xì)胞就能產(chǎn)生大量單一類(lèi)的功能。因此，這種雜交瘤細(xì)胞就能產(chǎn)生大量單一類(lèi)型的高純度抗體，

26、型的高純度抗體，單克隆抗體單克隆抗體。Georges J.F. KhlerCsar MilsteinNiels K. Jerne 1984年，年， G. Kohler、C. Milstein和和Niels K. Jerne獲得獲得Nobel獎(jiǎng)，表彰他們關(guān)于免疫控制機(jī)制理論的研獎(jiǎng)，表彰他們關(guān)于免疫控制機(jī)制理論的研究以及開(kāi)發(fā)制備單克隆抗體技術(shù)。究以及開(kāi)發(fā)制備單克隆抗體技術(shù)。 單克隆抗體技術(shù)的核心是用單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴淋巴細(xì)胞細(xì)胞(antigen stimulated B lymphoblast)

27、融合得融合得到到雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱(chēng)為雜交瘤技術(shù)單克隆抗體技術(shù)又稱(chēng)為雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology）。）。動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)為生產(chǎn)單克隆抗體過(guò)程動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)為生產(chǎn)單克隆抗體過(guò)程（1） 免疫小鼠、制備免疫小鼠、制備B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 取取6-8周齡周齡Balb/C雌鼠，基礎(chǔ)免疫雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周后，再靜脈周后，再靜脈加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫一次，

28、3-5天后分離、制備天后分離、制備B淋巴細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次次(37)，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞。細(xì)胞。（2） 制備骨髓瘤細(xì)胞制備骨髓瘤細(xì)胞 收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次次(37)，計(jì)，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞數(shù)活力細(xì)胞(不少于不少于90)。（3） 細(xì)胞融合細(xì)胞融合(1) 按1：5-10混合B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。(2) 將1ml 40的PEG液一滴滴加入細(xì)胞混合物中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管；(3)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1ml無(wú)血清培養(yǎng)液

29、，60秒鐘內(nèi)加完；(4)于5分鐘內(nèi)慢慢加入20ml無(wú)血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感，HATHAT選擇：選擇：淋巴細(xì)胞及其融合細(xì)胞：淋巴細(xì)胞及其融合細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，不能生長(zhǎng)，5 57 7天死亡；天死亡；骨髓瘤細(xì)胞及其融合細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞及其融合細(xì)胞：DNADNA從頭合成途徑被阻從頭合成途徑被阻斷；斷；HGPRTHGPRT缺乏，缺乏，DNADNA合成的補(bǔ)救途徑受阻，不能生合成的補(bǔ)救途徑受阻，不能生長(zhǎng)，長(zhǎng)，5 57 7天死亡；天死亡；淋巴細(xì)胞和骨髓瘤融合細(xì)胞：淋巴細(xì)胞和骨髓瘤融合細(xì)胞：能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)(5)離心(800轉(zhuǎn)/分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(6)取96孔板，每孔加50l，再加取等體積細(xì)胞懸液。(7)在CO2培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)； 24h后更換成HAT選擇性培養(yǎng)液（4） 雜交瘤細(xì)胞的選擇和克隆化培雜交瘤細(xì)胞