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1、冰凍切片切片RNAFISH方法及詳細步驟1.檢測理RNA熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization),簡稱為RNAFISH,是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。傳統(tǒng)的RNAFISH,直接在oligos上標記熒光素,根據(jù)堿基互補配對原則,與待檢測的RNA特異結(jié)合,通過熒光顯微鏡以檢測熒光信號,該方法一般需要20個oligos以上,以便檢測到較強較多的熒光信號點。本系統(tǒng)中SA(鏈霉親和素蛋白)是一類四聚體蛋白,大小為66KDa,每一分子SA能夠與四分子生物素進行高度特異性的結(jié)合,且兩者之間的親和力較強。應用該原理,我們將染料Cy3偶聯(lián)到SA蛋白上,一分子SA能偶聯(lián)上
2、6個Cy3;同時在探針上標記生物素,將兩者在體外進行親和連接,大約每個SA能與4條oligoBiotin結(jié)合,每個SA上有6個Cy3,也就是每一條探針上連接了6個Cy3,因此該方法具有一定的放大信號的作用。1. 具體步驟:1)復水冰凍切片取出,每張切片滴加BufferB100卩,室溫放置15min(使組織細胞恢復活性);2)吸棄BufferB,PBS洗切片兩次,每次5min(建議在染缸中進行)。2. 蛋白酶K消化1)蛋白酶K工作液預熱至37°C;2)每張切片滴加蛋白酶K工作液100卩1,37°C孵育20min(消化時間請根據(jù)不同樣本進行調(diào)整);3)吸棄蛋白酶K,每張切片滴加
3、100卩1lx封閉液,37度30min;4)吸棄1X封閉液,每張切片滴加100m2xBufferC在室溫下漂洗切片3-3oeHi£°(H91-31MSSWgT3o££尋阜w習船觀刃馬網(wǎng)至EOOl曲耿巨蠱匹程主導)49121MS3o££7出祁匹程囚削壬畐(9【出卑型出卑田出逆黑丁黑'翌呂國目旳図馬網(wǎng)歪E001曲耿出酸羽鶯出酸畐訊丞W'尊睡男軟($【E國3冋尹日E06業(yè)翌助工目旳E01駁丁坯(V【皤l:8T:1zT:L1:1皿同i鋼祁日£3-VS吐憐旳舌翰軌章誣涮jb)uiui0£L£%HdE
4、8+£3-VST/【ounilEl+sqoid-upoiqq/iouirl【pil脂7麥剌pi01幻)S9dlYtffl鋼每f£X3-VS呂馬逐uiuioi刃夠怒W“71"詢l吏餾翌細帰輻:型呦工屜晦(£-助蟄曜蚩歐纟笛礙'003-壬馬翱采礙馬慕B馬飛氐蜃翌馬劉申1/1°001電歸哥里劃脂馬E嚮WDdsaBM川厶"YDC出晉儒附士目旳ao鶯丑iM'li巾=09乙ao®owu:皿同'093ao/qoniu:糜摩竺均丁由旱緲華聲專墾摩叵:SS+Bf(3-簞藝豊臬吏出0£3o££
5、;丑咚醉32Jjn日(【彌P°(馬飛出)啻仕申皿'口凹3他'*珊%001、06、08'%0厶星*雖哥謝(£5凹8縣繩DoW1001翌環(huán)歪慚誣聊耿出酸羽鶯(3【型殊!罡晞誣Do8£(I2)輕輕去掉蓋玻片,吸棄雜交溶液,每張切片滴加預熱的雜交后水洗溶液100卩1洗切片15min;)每張切片滴加2xBufferC100卩1,0口洗3次,每次10min;4)吸棄2xBufferC,每孔加入100卩1的2xBufferC,置于37洗滌10min,洗滌3次。(如果背景深時,建議適當提高洗滌溫度及次數(shù))6.細胞核染色1)每張切片加100卩1稀釋好的DAPI工作液,在室溫下避光孵育10-20min(根據(jù)樣本的種類,建議適當調(diào)整DAPI的
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