利用多重PCR鑒定西瓜雜交種純度

1、利用多重PCR鑒定西瓜雜交種純度利用多重PCR鑒定西瓜雜交種純度2871202102-017-05IdentificationofpurityofwatermelonhybridsbymultiplexPCRYANGHuihui1，LIHewei1，ZHAOYongwei2，YUANShengkai1，2，YANGLuming1，HUJianbin1，SUNShouru1，MAChangsheng1，2，ZHUHuayu11.CollegeofHorticulture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，Henan，China;2.Henan

2、YuyiSeedIndustryTechnologyDevelopmentCo.，Ltd.，Zhengzhou450002，Henan，ChinaAbstract：Inordertoquicklyandefficientlyidentifythepurityofwatermelonhybrids，acompleteSSRmolecularmarkeridentificationsystemwasestablished.Inthisstudy，192pairsofSSRmarkerscoveringthewholegenomeofwatermelonwereusedtoscreenpolymor

3、phismsofthesmallfruitwatermelonvarietyJinxiaNo.8，and36bandswithclearandpolymorphicSSRmarkerswereobtained，thepolymorphismratewas18.8%，andthesemarkerswerelocatedonchromosomes1，2，3，4，5，6，8，10，and11，respectively.Basedontheamplifiedfragmentsizeofthesepolymorphicmarkers，4pairswereselectedfordoublePCRandtr

4、iplePCRgroupamplification，andthedoubleandtriplePCRpurityidentificationsystemsofJinxiaNo.8hybridsweresuccessfullyestablished.Theresultsofthethreepairsofmarkerswerebasicallyconsistent，andthepurityoftheJinxiaNo.8hybridwas100%.Theresultsofmarkeridentificationwerehighlyconsistentwiththoseoffieldmorpholog

5、icalidentification.Forthefirsttime，thetriplePCRtechniquewasusedtoidentifythepurityofwatermelonhybrids，whichlaidasolidfoundationfortheefficientandrapididentificationofwatermelonhybrids.Keywords：Watermelon;Moleculermarker;MultiplexPCR;Purityidentification西瓜Citrulluslanatus為葫蘆科西瓜屬一年蔓生草本植物，是世界上重要的園藝作物之一

6、。中國是西瓜最大的生產(chǎn)和消費國，西瓜栽培歷史悠久。在育種過程中，因品種鑒定所需周期較長，費用較高，且鑒定的結(jié)果具有不確定性，所以種子的純度鑒定是一項難題，而種子的質(zhì)量直接影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)及農(nóng)民的收益，因此，對雜交種進行純度鑒定以保證種子質(zhì)量及生產(chǎn)效益是極其必要的1。常用的種子純度鑒定方法有形態(tài)學鑒定和分子鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定易受環(huán)境、氣候和人為因素的影響，且存在費時費地費勁等缺點2。利用分子標記技術(shù)能夠從DNA水平上檢測雜交種和親本之間的差異，克服了空間的限制，極大縮短了檢驗所需時間3。目前常見的分子標記有RAPD標記、SRAP標記、EST-SSR標記等，但是利用這些標記進行純度鑒定具有局限

7、性，而SSR標記具有數(shù)量豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)點，適于進行雜交種純度的鑒定4-5，如孫波等6利用SSR分子標記技術(shù)對西瓜品種雪龍三號進行種子純度鑒定，鑒定結(jié)果驗證了西瓜品種的真實性。但是討論者多數(shù)是利用單一PCR擴增鑒定品種真實性，此做法雖然可以區(qū)分出親本自交株，但是對于品種間的機械混雜則難以區(qū)分。3商量與結(jié)論目前市場上銷售的西瓜種子均為雜交一代，種子純度是其質(zhì)量的重要指標之一13。根據(jù)國家標準的規(guī)定，西瓜雜交品種的純度必需高于95%14。在人工生產(chǎn)種子的過程中，母本去雄不徹底、機械混雜和生物學混雜等緣由都會降低種子純度。綜合前人對西瓜品種純度鑒定的討論，多數(shù)討論者利用單一的

8、PCR擴增確定品種的真實性，雖然可以區(qū)分出親本自交種，但對品種間的機械混雜鑒定存在局限性。前人證明了SSR分子標記技術(shù)的可行性15。孫波等6利用23對SSR核心引物對西瓜品種進行純度鑒定，其結(jié)果充分說明了SSR分子標記鑒定品種純度的可靠性。張佩倫等16利用SSR標記對4個西瓜品種進行純度鑒定，其結(jié)果與田間形態(tài)學鑒定結(jié)果高度一致。利用單一引物進行雜交種純度鑒定時，多數(shù)討論者大多實行熱堿法、SDS法等快速提取植物基因組DNA的方法;但是利用多重PCR進行鑒定時多數(shù)討論者則是實行CTAB法提取DNA17-18;常宏等19在對玉米種子真實性的鑒定中得出，相比較CTAB法和熱減法提取的DNA，CTAB法

9、提取的DNA質(zhì)量較高，且電泳結(jié)果主帶較清晰;而熱減法提取的DNA質(zhì)量較差，主帶出現(xiàn)嚴峻拖尾。胡倩梅等9利用堿裂法提取甜瓜葉片DNA，構(gòu)建多重PCR體系，發(fā)覺利用4對引物同時進行擴增時會影響推斷條帶的精確性，添加2對和3對引物可以精確推斷引物擴增出的條帶。所以，對于粗提DNA的方法是否可以應(yīng)用到多重PCR鑒定西瓜純度，有待于進一步討論。筆者通過對覆蓋西瓜全基因組的192對引物進行篩選，36對引物在錦霞八號及其親本之間具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為18.8%，從中選擇4對位于西瓜不同染色體上的SSR標記檢測錦霞八號純度。通過構(gòu)建雙重和三重PCR體系，對錦霞八號雜交種進行純度鑒定，雙重PCR結(jié)果和三重PCR結(jié)果基本吻合。分子鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果高度一致，與前人討論結(jié)論一致。利用SSR分子標記技術(shù)對西瓜雜交種進行純