維生素C生產(chǎn)工藝綜述

1、維生素C生產(chǎn)工藝綜述摘要:介紹了維生素C 的性質(zhì)、功能和用途。綜述了維生素C 生產(chǎn)技術(shù)的演變過(guò)程和發(fā)展趨勢(shì)。著重探討了微生物發(fā)酵法的生產(chǎn)工藝進(jìn)展。介紹了二步發(fā)酵法的研發(fā)現(xiàn)狀,探討了2 - 酮基- L- 古龍酸的分離提取工藝。展望了我國(guó)維生素C 生產(chǎn)技術(shù)的前景。關(guān)鍵詞:維生素C ,功能,二步發(fā)酵法,發(fā)酵,2 - 酮基- L 古龍酸,分離提取The Overview on the Production Process of Vitamin CAbstract : Characters , functions and uses of vitamin C are introduced. Develop

2、mental process and trend of industrial technology on vitamin C are reviewed. Advances in industrial technology of microbiological fermentation method are discussed emphatically. After present situation of R &D of the two steps fermentation method is introduced , the separation and purification p

3、rocesses of 2- keto-L- gluconic acid are discussed. The direction of industrial technology on vitamin C in China is previewed. Key words : Vitamin C ,Function , Two steps fermentation method ,Fermentation , 2- keto-L-gluconic acid , Separation and extraction 維生素C(vitaminC ,以下簡(jiǎn)稱Vc) 又名L - 抗壞血酸(L - asc

4、orbicacid) ,是一種人體必需的水溶性維生素。Vc 廣泛存在于生物組織中,在新鮮水果、蔬菜和動(dòng)物肝臟等中的含量尤為豐富。綠色植物能夠自己合成Vc ,而人和許多動(dòng)物由于肝臟中缺少一種古洛內(nèi)酯氧化酶,因而不能自己合成,必須從外界攝取。1.維生素C 的性質(zhì)、功能和用途1.1性質(zhì)純維生素C 在常溫下為無(wú)色晶體,味酸,易溶于水。Vc 在結(jié)晶狀態(tài)尚穩(wěn)定,而在水溶液中則很不穩(wěn)定,容易為加熱、氧化所破壞。L-抗壞血酸具有較強(qiáng)的還原性,在體內(nèi)經(jīng)抗壞血酸氧化酶的作用可脫氫氧化成L-脫氫抗壞血酸,該脫氫反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)。還原型的L-抗壞血酸和氧化型的L-脫氫抗壞血酸均具有生理活性,它們構(gòu)成的一對(duì)氧化- 還

5、原系統(tǒng),在細(xì)胞代謝中起著重要的生理作用1 。1.2功能與用途Vc 在人體中具有廣泛的生理作用:1) 參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)2 ;2) 對(duì)抗自由基損傷3 ;3) 改善機(jī)體免疫功能4 ; 4) 參與膠原蛋白和細(xì)胞間質(zhì)的合成2 ;5) 參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成2 ;6) 參與氨基酸代謝與鐵代謝2 ;7) 抑制血小板及白細(xì)胞活化2 ;等等。因此,Vc 在壞血病5 、感冒、心血管缺陷、高膽固醇、糖尿病、精神抑郁癥6 、危重型克山病等疾病的臨床治療中均具有重要的用途。此外,Vc還可以用作食品添加劑、飼料添加劑、某些農(nóng)作物的催熟劑、化妝品工業(yè)防銹劑6 ,等等。2.Vc 的生產(chǎn)方法2.1萊氏法萊氏法是1933年德國(guó)化

6、學(xué)家Reichstein等發(fā)明的最早應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)VC的方法。該法以葡萄糖為原料,經(jīng)催化加氫制取D - 山梨醇,然后用醋酸菌發(fā)酵生成L - 山梨糖,再經(jīng)酮化和化學(xué)氧化,水解后得到2 - 酮基- L - 古洛糖酸(2 - KLG) ,再經(jīng)鹽酸酸化得到VC。萊氏法生產(chǎn)的VC產(chǎn)品質(zhì)量好、收率高。由于生產(chǎn)原料廉價(jià)易得,中間產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,至今仍是許多國(guó)外VC生產(chǎn)商,如Roche公司、BASF / Takeda 公司和E. Merck公司等廠商采用的主要工藝方法。但是萊氏法也存在不少缺陷,諸如生產(chǎn)工序多、勞動(dòng)強(qiáng)度較大,使用大量有毒、易燃化學(xué)藥品,容易造成環(huán)境污染等。為此,自20世紀(jì)60年代起,各國(guó)學(xué)

7、者一直致力于萊氏法的改進(jìn)。其過(guò)程如圖1所示： H2/ Ni 醋酸桿菌 丙酮/ H2SO4D-葡萄糖 D-山梨醇 L-山梨糖 雙丙酮-L-山梨糖 高壓 O 水解 化學(xué)轉(zhuǎn)化 雙丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸 2- KLC VcNiSO4 圖1 萊氏法生產(chǎn)Vc 的工藝流程2.2二步發(fā)酵法我國(guó)的混合菌發(fā)酵工藝是20 世紀(jì)70 年代由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和北京制藥廠共同建立的，包括2 個(gè)發(fā)酵步驟，故稱兩步發(fā)酵法。第一步是在醋酸桿菌作用下將D山梨醇氧化為L(zhǎng)山梨糖，俗稱醇糖轉(zhuǎn)化，目前國(guó)外對(duì)其相關(guān)基因和轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究已經(jīng)比較清楚； 第二步是在一種混合菌系的作用下將L山梨糖進(jìn)一步氧化為KGA，俗稱糖酸轉(zhuǎn)化7。上

8、述混合菌系包括2 種微生物，直接負(fù)責(zé)山梨糖生物氧化的微生物俗稱小菌，最初曾被鑒定為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）， 最近Urbance等8 經(jīng)系統(tǒng)分類學(xué)鑒定對(duì)其重新命名為普通酮古龍酸菌（Ketogulonigenium vulgare）。另一種微生物俗稱大菌，本身不能轉(zhuǎn)化山梨糖，作為伴生菌起到輔助小菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的作用。許多微生物具有這種伴生菌的作用， 生產(chǎn)中常用的有臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bmegaterium）、蘇蕓金芽孢桿菌（Bthuringiensis）等。目前國(guó)內(nèi)Vc 生產(chǎn)廠家都采用混合菌發(fā)酵法， 該法是惟一成功應(yīng)用

9、于大規(guī)模Vc 工業(yè)生產(chǎn)的微生物轉(zhuǎn)化法，具有糖酸轉(zhuǎn)化效率高的突出優(yōu)勢(shì)。目前我國(guó)Vc 生產(chǎn)規(guī)模占世界總生產(chǎn)規(guī)模的2 3，其中80的產(chǎn)品用于出口，是我國(guó)醫(yī)藥領(lǐng)域的支柱產(chǎn)業(yè)?；旌暇l(fā)酵法在國(guó)內(nèi)的成功應(yīng)用也引起了國(guó)外的廣泛關(guān)注。1986 年，我國(guó)的兩步發(fā)酵法向瑞士Hoffmann LaRoche 公司進(jìn)行了技術(shù)轉(zhuǎn)讓。其過(guò)程如圖2所示： H2/ Cat 醋酸桿菌 大菌、小菌D - 葡萄糖 D - 山梨醇 D - 山梨糖 2 KLG 混合發(fā)酵 化學(xué)轉(zhuǎn)化 Vc 圖2二步發(fā)酵法生產(chǎn)Vc 的工藝流程大、小菌關(guān)系的研究進(jìn)展二步發(fā)酵法中的第二步發(fā)酵是由氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans） 和

10、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）混合發(fā)酵完成的，前者為產(chǎn)酸菌俗稱小菌，但單獨(dú)培養(yǎng)傳代存活率及產(chǎn)酸能力較低。后者為伴生菌俗稱大菌，它不產(chǎn)酸，混合培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)酸顯著提高?；旌习l(fā)酵中大小菌兩者關(guān)系復(fù)雜，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。魏東芝9曾提出大菌為小菌提供某種生長(zhǎng)因子促進(jìn)小菌生長(zhǎng)的設(shè)想。馮樹等10研究證實(shí)，大菌胞內(nèi)液和胞外液均可促進(jìn)小菌生長(zhǎng)，大菌胞外液中具有該作用的組分分子量在100kDa以上；大菌胞外液具有促進(jìn)小菌產(chǎn)酸，其胞內(nèi)液無(wú)該作用；大菌胞外液中具有該活性作用的組分為30-50kDa和大于100kDa兩個(gè)部分。其中前者是一種含鐵和鋅的蛋白質(zhì)，該活性蛋白的形成規(guī)律和作用機(jī)制尚

11、在探索中。焦迎暉11等通過(guò)分析Vc二步發(fā)酵過(guò)程中活菌產(chǎn)酸量、糖酸轉(zhuǎn)化活力等，證明了大菌的胞外液或胞內(nèi)液對(duì)小菌休止細(xì)胞的糖酸轉(zhuǎn)化活力并沒(méi)有直接影響，即大菌的作用僅僅是促進(jìn)小菌的生長(zhǎng)，而對(duì)產(chǎn)酸的促進(jìn)作用是因使小菌密度提高的結(jié)果。目前，大、小菌的詳細(xì)混生機(jī)制尚未完全明了，仍需人們進(jìn)一步探索。菌種選育的研究有關(guān)二步發(fā)酵法中的第二步發(fā)酵過(guò)程的菌種選育一直是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C研究的熱點(diǎn)課題之一，我國(guó)學(xué)者作了大量的工作。尹光琳等7采用紫外照射、化學(xué)誘變和原生質(zhì)體融合等方法選育得到的新組合菌系SCB 329SCB 933的發(fā)酵周期僅4050h，產(chǎn)酸達(dá)115130mg/mL，轉(zhuǎn)化率約為90%。焦鵬等12運(yùn)

12、用SMA探針技術(shù)HBHG影印技術(shù)篩選得到了一株蛭弧菌J26，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生2KLG的發(fā)酵單位為5060 mg/mL。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，該菌株的發(fā)酵單位已達(dá)到83.9%91.7%。許安等13利用離子注入技術(shù)選育出的2KLG高產(chǎn)菌系IPPM1028，其轉(zhuǎn)化率較出發(fā)菌M2980提高18.8%，發(fā)酵周期為6064h，2KLG濃度可達(dá)70 mg/mL左右，轉(zhuǎn)化率為95%。李越中6 采用含pUB 110質(zhì)粒的小菌轉(zhuǎn)化子（KmrSts）與Q132（KmsStr）大菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，獲得可連續(xù)傳代10代以上的小菌，這將為實(shí)現(xiàn)小菌的單獨(dú)培養(yǎng)以及對(duì)小菌的遺傳學(xué)研究打下基礎(chǔ)。陳建華等14用配對(duì)法篩選得一株氧化葡萄糖

13、酸桿菌（Gluconobacter oxydans）103的優(yōu)良伴生菌短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）97002,L山梨糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)90%左右。初步嘗試兩菌屬間原生質(zhì)體融合。盡管有關(guān)二步發(fā)酵法第二步發(fā)酵過(guò)程的菌種選育的研究進(jìn)行了很多，但仍處于實(shí)驗(yàn)室研究或小試階段。發(fā)酵工藝條件的研究微生物發(fā)酵是一個(gè)極其復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程?；|(zhì)濃度、溫度、PH等因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成都會(huì)產(chǎn)生直接影響。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者對(duì)二步發(fā)酵法工藝進(jìn)行了深入的研究。魏東芝等9研究了VC二步發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵中大小菌生長(zhǎng)規(guī)律及基質(zhì)和產(chǎn)物的變化，建立了簡(jiǎn)化的動(dòng)力學(xué)模型，在一定程度上揭示了2KLG發(fā)酵系

14、統(tǒng)的本質(zhì)特征，為分析發(fā)酵過(guò)程，指導(dǎo)生產(chǎn)及實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)自動(dòng)化奠定了基礎(chǔ)。張忠澤15等通過(guò)優(yōu)化通氣、溫度和金屬離子等環(huán)境因子，顯著改善了二菌協(xié)同共生效果，醇酸轉(zhuǎn)化率提高了2.33%，發(fā)酵周期縮短了2.8h。針對(duì)L山梨糖濃度不高的問(wèn)題，尹光琳等7通過(guò)對(duì)新組合菌系SCB329SCB933批加L山梨糖技術(shù)的研究，既避免了高糖對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，又能利用菌株的優(yōu)良特性，使底物濃度提高到14%?？祵W(xué)真16等通過(guò)對(duì)VC二步發(fā)酵中大小菌的比例對(duì)產(chǎn)酸的影響，測(cè)定和分析了零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)種子的生長(zhǎng)曲線，得出了各級(jí)種子的最適培養(yǎng)時(shí)間、零級(jí)種子培養(yǎng)最初接種量及大小菌的接種比例，對(duì)實(shí)踐有指導(dǎo)作用。蔣宇揚(yáng)、張成剛17研制

15、了幾種稀土元素化合物，考察了它們對(duì)2酮基L古龍酸還原酶（KGR）及在L山梨糖發(fā)酵中對(duì)2KLG產(chǎn)酸的影響，搖瓶試驗(yàn)結(jié)果表明，在L山梨糖發(fā)酵中加入稀土元素化合物，發(fā)酵時(shí)間縮短6h，2KLG產(chǎn)酸量提高超過(guò)6 mg/mL。李越中6采用聚乙烯/海藻酸鈣包埋對(duì)大、小菌進(jìn)行固定化，獲得高于游離菌的產(chǎn)酸量；并采取種子液活化的方法使固定化細(xì)胞半衰期延長(zhǎng)至10批次。提取工藝二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后,發(fā)酵液中僅含8 %左右的2 - KLG,而殘留菌絲體、蛋白質(zhì)、多糖或懸浮微粒等雜質(zhì)的含量卻很高。這給2 - KLG的分離提純帶來(lái)了很大困難,致使后處理費(fèi)用占總成本的比例較大。目前, VC工業(yè)生產(chǎn)中常用的2 - KLG的分

16、離提純方法有加熱沉淀法、化學(xué)凝聚法和超濾法。(1)加熱沉淀法加熱沉淀法是2 - KLG分離提純的傳統(tǒng)工藝,分離手段較為落后。此工藝通用氫型樹脂,調(diào)pH至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)后加熱除蛋白。采用此工藝會(huì)造成有效成分在高溫下降解損失,且發(fā)酵液直接通過(guò)樹脂柱,造成樹脂表面污染,降低樹脂的交換容量和收率。兩次通過(guò)樹脂柱帶進(jìn)了大量水分,也增大了濃縮耗能。(2)化學(xué)凝聚法化學(xué)凝聚法是通過(guò)加入化學(xué)絮凝劑來(lái)除去蛋白質(zhì)、菌體、色素等雜質(zhì),避免了加熱沉淀時(shí)有效成分的損失。季光輝等 18 采用化學(xué)凝聚法對(duì)VC發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理,使2 -KLG的濾液質(zhì)量提高,提取前步收率提高5. 2% , VC總收率提高2. 5%以上。陳雷等

17、19 以殼聚糖為主凝劑,聚丙烯酰胺為助凝劑,通過(guò)化學(xué)凝聚法除蛋白工藝,提取收率由原來(lái)的76%提高到82% ,古龍酸優(yōu)級(jí)品率由原來(lái)的35%提高到60% ,成本比原來(lái)降低20%。但是,化學(xué)凝聚法也存在不足,主要表現(xiàn)在處理后的發(fā)酵液離心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白,如發(fā)酵液染菌則處理的效果更不明顯,上清液渾濁,嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量和收率。此外,所用的化學(xué)絮凝劑也可能對(duì)環(huán)境造成污染。(3)超濾法超濾是一種新興的膜處理技術(shù),此法具有操作方便、節(jié)能、不造成新的環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn),因此在2 - KLG的分離提純中的應(yīng)用日益廣泛 20 。此法與加熱沉淀法不同的是,可在常溫下操作,可減少有效成分的損失; 在用

18、膜除蛋白的過(guò)程中,無(wú)任何新的化學(xué)物質(zhì)加入,可減少對(duì)樹脂的污染和損耗,降低酸堿用量,減少三廢排放。與化學(xué)凝聚法不同的是,在處理染菌的發(fā)酵液時(shí)仍可達(dá)到較好的處理效果。我國(guó)的東北制藥廠1995 年從丹麥引進(jìn)目前全國(guó)最大膜面積的平板超濾裝置后, 2 - KLG的分離提純成本比原先的化學(xué)凝聚法節(jié)約了600萬(wàn)元,其收率和生產(chǎn)的自動(dòng)化、連續(xù)化程度也明顯提高 21。隨著新型膜材料技術(shù)的開發(fā),如陶瓷膜、不銹鋼膜等的應(yīng)用,超濾法的應(yīng)用效果會(huì)有進(jìn)一步的提高。同時(shí),國(guó)內(nèi)外正在探索反滲透、納濾等后序處理新工藝的應(yīng)用,以完善工藝聯(lián)結(jié)22 。(4)其它方法除上述三種方法外,目前還有仍處于小試階段的離子交換法和溶媒萃取法的研

19、究報(bào)道。劉坐鎮(zhèn)等23用離子交換法對(duì)發(fā)酵液中2 - KLG的提取工藝進(jìn)行了研究,系統(tǒng)考察了四種大孔弱堿性陰離子交換樹脂對(duì)2 - KLG的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能以及影響因素,并對(duì)洗脫條件進(jìn)行了探索。錢衛(wèi)國(guó)等24對(duì)溶媒萃取法的提取工藝進(jìn)行了初步研究,篩選出了較為合適的萃取劑、稀釋劑、助萃劑和反萃劑,考察了pH值、無(wú)機(jī)酸和相比對(duì)萃取性能的影響,并對(duì)三級(jí)逆流萃取過(guò)程進(jìn)行了串聯(lián)模擬。轉(zhuǎn)化工藝無(wú)論是萊氏法還是二步發(fā)酵法制得的2 - KLG,目前在生產(chǎn)上都是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程轉(zhuǎn)化為VC。根據(jù)所選試劑的不同,二步發(fā)酵法可分為酸轉(zhuǎn)化法和堿轉(zhuǎn)化法 25 。(1)酸轉(zhuǎn)化法VC化學(xué)轉(zhuǎn)化生產(chǎn),自萊氏法建立以來(lái)就采用濃鹽酸催化2

20、 - KLG ,一步制得VC。國(guó)外有關(guān)學(xué)者對(duì)此法進(jìn)行了許多研究。印度Ahmedbad Textile 工業(yè)研究協(xié)會(huì)研究表明,在以飽和氯代烴(如CHCl3 ) 、芳烴(如苯、甲苯)為溶劑,由2 - KLG與濃鹽酸在6075 下反應(yīng)46 h ,可制得純度為90 %的粗VC26 。美國(guó)學(xué)者YOD ICE 等 27 于1985 年報(bào)道了2 - KLG 與濃鹽酸在表面活性劑Me(CH2 ) 5N +Me3Cl的甲苯溶液中反應(yīng),可制得純度超過(guò)99%的VC。近年來(lái),關(guān)于一步酸轉(zhuǎn)化法制VC的研究報(bào)道更是層出不窮。1999 年,美國(guó)有關(guān)專利指出,在氧化鈷為催化劑的體系中, 2 - KLG與足量的次氯酸反應(yīng)可制得

21、高純度的VC 28 。2000年,德國(guó)學(xué)者FECHTEL等 29報(bào)道了2 -KLG與濃鹽酸在4. 5Mpa的高壓釜中于42 反應(yīng)3 h ,可制得VC,收率高達(dá)95 %。酸轉(zhuǎn)化法工藝簡(jiǎn)單,操作步驟少,但反應(yīng)過(guò)程中選用濃鹽酸對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重。另外,由于在反應(yīng)體系中引入了惰性溶劑或表面活性劑,使后期的分離造成不便。(2)堿轉(zhuǎn)化法我國(guó)VC生產(chǎn)廠家均采用堿法轉(zhuǎn)化2 - KLG生產(chǎn)VC。東北制藥總廠等生產(chǎn)單位將2 - KLG與甲醇在濃硫酸催化下生成2 - 酮基- L - 古龍酸甲酯,該酯在NaHCO3 作用下發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng)生成VC鈉鹽。該法避免了酸催化的上述缺點(diǎn),且操作工藝簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件溫和,適合于規(guī)?；?/p>

22、產(chǎn),但是在生產(chǎn)中的反應(yīng)周期過(guò)長(zhǎng),甲醇單耗高30。有些單位嘗試用CH3ONa代替NaHCO3 進(jìn)行堿轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率可高達(dá)92. 6 % ,但產(chǎn)品質(zhì)量較差,且甲醇鈉價(jià)格貴,造成生產(chǎn)成本較高31 。國(guó)外學(xué)者對(duì)堿轉(zhuǎn)化的研究也一直在進(jìn)行。Bottcher等32 用丁醇代替甲醇,采用濃硫酸催化,在真空度0. 02MPa 、85 的條件下與2 - KLG進(jìn)行反應(yīng), 2 h后蒸去多余的丁醇及生成的水,向反應(yīng)體系中加入氯乙烯和鹽酸,在7275 加熱17 h,過(guò)濾后得到純度為98 %的VC。Veits 33 用離子交換樹脂作催化劑,使2 - KLG與甲醇的反應(yīng)液于80 下在樹脂柱中停留10120 min,然后將酯化

23、液與NaHCO3 作用得到純度為98 %的粗VC鈉鹽。美國(guó)Fastman化學(xué)公司的研究人員將模擬流動(dòng)床( SMB)反應(yīng)器應(yīng)用于該酯化反應(yīng),通過(guò)SMB反應(yīng)器脫水以促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行 34 。Oklobdzu等 35 通過(guò)二步酯化過(guò)程促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行,有效地實(shí)現(xiàn)了分離反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)過(guò)程中生成的水。由VC鈉鹽制備VC所采取的主要方法是硫酸酸化法和樹脂交換法36 。硫酸酸化法操作簡(jiǎn)單,但需妥善控制甲醇的濃度和pH值,才能使硫酸鈉與VC得以分離。氫型離子樹脂交換法設(shè)備龐大,操作復(fù)雜,且需經(jīng)常再生樹脂,增加了酸耗,酸液大量排放容易對(duì)環(huán)境造成威脅。目前,人們正在積極探索使用雙極性膜(BipolarMemb

24、rane Electrodial2ysis,BME)來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酸化工藝 3739 ,其工作原理為:在直流電場(chǎng)作用下, 雙極性膜中的水被離解成H+和OH- ,H +替換VC鈉鹽中的Na +結(jié)合成離解度小的VC,原VC鈉鹽中的Na +在電場(chǎng)的作用下通過(guò)陽(yáng)離子交換膜從VC鈉鹽中分離出來(lái), 并和OH- 結(jié)合生成NaOH。雙極性膜電滲析法無(wú)需外加物料可將VC鈉鹽轉(zhuǎn)化成VC,過(guò)程簡(jiǎn)單,能耗低,投資少,轉(zhuǎn)化率高,其副產(chǎn)品和NaOH稀溶液也可被有效利用,對(duì)環(huán)境無(wú)污染,有望應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。2.3新二步發(fā)酵法新二步發(fā)酵法最先是由日本鹽野義制藥公司園天高康等發(fā)明的，也稱葡萄糖串聯(lián)發(fā)酵法40，其工藝流程如圖3所示

25、。 歐文氏菌 幫桿菌 化學(xué)轉(zhuǎn)化D - 葡萄糖 2 ,5 DKG 2 - KL G Vc 圖3 新二步發(fā)酵法工藝流程園天高康等41用歐文氏菌SHS 2006突變株和棒狀桿菌SHS 2007的突變株進(jìn)行10t串聯(lián)發(fā)酵的中間實(shí)驗(yàn)表明，由葡萄糖到2KLG的總轉(zhuǎn)化率為84%。我國(guó)的尹光琳7等20于20世紀(jì)90年代初已經(jīng)開始進(jìn)行這方面的研究，他們誘變選育出歐文氏菌（Er-winiasp.）SCB 247產(chǎn)2,5DKG的能力提高了22.8%，所得到棒狀桿菌誘變株SCB 3058具有較高的產(chǎn)2KLG能力（2.14mg/mL）。另外， 張剛等42對(duì)SCB 247和SCB 3058串聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)2KLG的工藝條件也做

26、了研究，得出了類似的結(jié)果。這些研究為進(jìn)一步簡(jiǎn)化的生產(chǎn)工藝打下了基礎(chǔ)。新二步發(fā)酵法省去了D葡萄糖加氫生成D山梨醇的步驟，大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工序，收率也很高，很有應(yīng)用前途。但這種方法還存在許多問(wèn)題，如中間產(chǎn)物2，5DKG對(duì)熱不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率低，成本高。其在反應(yīng)條件、菌體利用等方面，與工業(yè)生產(chǎn)還具有一定的距離。2.4一步發(fā)酵法不能以葡萄糖作為直接發(fā)酵原料是二步發(fā)酵法的最大缺陷之一。以D - 葡萄糖高壓加氫轉(zhuǎn)化生成D - 山梨醇,不僅需要大量的能源和設(shè)備,操作上也存在很大的危險(xiǎn)性?？紤]若能將歐文氏菌和棒狀桿菌相關(guān)的特性結(jié)合于一種微生物中,構(gòu)建VC“基因工程菌”,就可實(shí)現(xiàn)從D - 葡萄糖到2 - KLG的一

27、步發(fā)酵。近年來(lái),基因工程菌的研究已成為世界上熱點(diǎn)課題之一,美國(guó)、瑞士、法國(guó)、日本等許多國(guó)家都著力開展了此方面的研究。其過(guò)程如圖4所示： 工程菌 化學(xué)轉(zhuǎn)化D - 葡萄糖 2 - KL G Vc圖4 一步發(fā)酵法工藝流程1985 年,美國(guó)Genen2tech 公司Anderson 等人 43 成功地分離純化了棒桿菌(Corynebacterium sp. ) ATCC31090的2, 5 - DKG還原酶,并分析了該酶N - 端的40個(gè)氨基酸序列,用原位雜交法從部分基因文庫(kù)中篩選到一個(gè)基因片段,再以已知片段為探針得到了完整基因,最終該基因被重組到了另一株發(fā)酵生產(chǎn)菌草生歐文氏菌( E. herbico

28、la ATCC21998)中,得以有效表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)了從D - 葡萄糖到2 - KLG的一步發(fā)酵。該法的合成效率很低,只有5%左右,主要是由于合成2, 5 -DKG的3種關(guān)鍵酶D - 葡萄糖脫氫酶、D - 葡萄糖酸脫氫酶、2 - 酮基- D - 古龍酸脫氫酶(存在于周質(zhì)中)與2, 5 -DKG還原酶(存在于胞質(zhì))在細(xì)胞中所處位置的較大差異造成。后來(lái)Grindley等 44 經(jīng)過(guò)改進(jìn), 將棒桿菌的2, 5 -DKG還原酶的基因在E. citreus 上表達(dá), 將收率提高至49%。國(guó)內(nèi)部分VC生產(chǎn)廠家以及中科院上海生物工程研究中心也在進(jìn)行此項(xiàng)課題的研究,并取得了很大的進(jìn)展。陳策實(shí)等 45 從棒狀桿

29、菌SCB 3058中初步純化得到的2個(gè)2, 5 - DKG還原酶,將2, 5 - DKG還原酶I基因片段在大腸桿菌中得到表達(dá)。所有這些都為最終構(gòu)建基因工程菌打下了基礎(chǔ)。由于至今尚未找到使葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)生VC的微生物菌種,目前發(fā)酵產(chǎn)生的2 - KLG到VC的轉(zhuǎn)化仍是通過(guò)化學(xué)方法。為了得到完整的使用細(xì)菌合成VC的生物轉(zhuǎn)化途徑,各國(guó)學(xué)者都在尋找能夠利用2 - KLG合成VC的菌種。目前, Asakura 等人 46 已從Zymomonas mobilis, Es -cherichia coli以及Fusarium oxysporum 中分離出了內(nèi)酯化酶,可以用于2 - KLG到VC的轉(zhuǎn)化,但是反應(yīng)

30、效率極低,尚有待進(jìn)一步研究。3.展望VC是我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)開發(fā)的首批西藥之一,也是我國(guó)最主要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。二步發(fā)酵法是我國(guó)VC生產(chǎn)的主要工藝方法,然而該法不能直接以葡萄糖為發(fā)酵原料,且涉及二步發(fā)酵三種菌,工序繁瑣。采用基因工程等先進(jìn)技術(shù),選育直接以葡萄糖為發(fā)酵原料的優(yōu)良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件將是我國(guó)VC生產(chǎn)技術(shù)研究的主要方向。此外,目前世界上很多國(guó)家正嘗試以真核生物為研究對(duì)象,利用它們合成VC的代謝途徑開發(fā)更加環(huán)保的生物合成方法 4749 。從我國(guó)的二步發(fā)酵法推廣后逐步取代萊氏法這一過(guò)程可以預(yù)測(cè),隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和更具優(yōu)勢(shì)的生物合成VC方法的不斷涌現(xiàn),生物法必將完全取代化學(xué)法在VC生

31、產(chǎn)中的地位。為了保持我國(guó)在世界VC生產(chǎn)上的優(yōu)勢(shì)地位,必須加強(qiáng)VC生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究工作。參考文獻(xiàn)：1 Prazeres DMF ,Cabral JMS1Enzymatic membrane bioreactors and their applications1Enzyme Microb1Technol. , 1994 , 16 : 738 - 7502 鮑揚(yáng). 維生素C 與營(yíng)養(yǎng). 腸與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng),1998 ,5 (3) :168 -1723Conner EM ,Grisham MB1Inflammmion free radicals ,and an-tioxidants1Nutrition ,199

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33、二步發(fā)酵混合菌的生理機(jī)制暨混合菌共固定化合成2 - 酮基- L 古龍酸的研究.博士后研究報(bào)告. 沈陽(yáng):中科院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)所7 尹光琳, 陶增鑫, 于龍華, 等 L山梨糖發(fā)酵產(chǎn)生Vc 前體2酮基L古龍酸的研究 I 菌種的分離篩選和鑒定J 微生物學(xué)報(bào), 1980,20(3):2462518 Urbance J W, Bratina B J, Stoddard S F, et al Taxonomic characterization of Ketogulonigenium vulgare gennovspnov and Ketogulonigenium robustum spnov, which

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