蘇州大學(xué)基因工程級生物技術(shù)專業(yè)試題A卷

1、蘇州大學(xué)基因工程（02級生物技術(shù)專業(yè)）試題（A卷）（2005.12）姓名 學(xué)號 得分 一 名詞解釋（4分/題，共20分）1 重疊基因 不同基因的核苷酸序列有時為相鄰兩個基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因2.鋅指結(jié)構(gòu)由兩個半胱氨酸（Cys）殘基和兩個組氨酸（His）殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu), 并以鋅輔基敖合形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為活性單位, 在指狀突出區(qū)表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)3.ScFv它是由抗體重，輕鏈的可變區(qū)基因(VH、VL)之間通過一段編碼連接肽基因，拼接后表達(dá)形成的重組蛋白。是一種具有抗原結(jié)合能力的最小抗體片段，可在一些不需Fc段效應(yīng)

2、功能的實(shí)際應(yīng)用中開展研究和應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)是分子量小，易于穿透組織到達(dá)靶器官發(fā)揮功效，易于構(gòu)建和生產(chǎn)，但易于被清除。4.基因置換是指將致病基因整個地被有功能的正?；蛩脫Q，使致病基因永久地得到更正。5基因敲除基因敲除是向正常生物個體內(nèi)引入某個突變的基因位點(diǎn)而選擇性地使某特定基因功能失活的技術(shù)。二 填空題 （3分/題，共15分）1. 細(xì)菌的移動基因存在著三種類型的轉(zhuǎn)位因子包括 插入序列 、 轉(zhuǎn)位子 、噬菌體Mu和D108 。2. Klenow酶在 有 dNTP 情況下，呈現(xiàn)DNA聚合酶活性，在 沒有dNTP 情況下呈現(xiàn)外切酶活性。3. 外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，常用的啟動子有 乳糖啟動子 、Trp

3、啟動子 、 Tac啟動子 、噬菌體的PL和PR啟動子 、 脂蛋白啟動子 。4. 在LacI標(biāo)記基因插入外源基因，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在X-gal培養(yǎng)基中顯 白 色，為 陽性 克隆，未插入基因的克隆顯 藍(lán) 色，為 陰 性克隆。5. 基因序列經(jīng)堿基替代，缺失或插入后，可使遺傳信息產(chǎn)生三種不同的后果，分別為 同義突變 、 錯義突變 、無義突變 。三 是非判斷題 （2分/題，共10分）1.DNA連接酶是一種能催化二條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，因此該酶既可修復(fù)基因序列中的缺口，也可修復(fù)裂口。 （ × ）2.質(zhì)粒提取后，在瓊脂糖電泳出現(xiàn)一條帶時說明質(zhì)粒提取純度高，當(dāng)為三條帶時為純度不高。（ &

4、#215; ）3COS位點(diǎn)，COS質(zhì)粒，COS細(xì)胞它們均含有用于自身環(huán)化的12個堿基的互補(bǔ)粘性末端。（× ）4.入噬菌體的插入型載體只有一個單一限制酶切點(diǎn)，替換型載體有2個成對的限制性酶切點(diǎn)。（ ）5.原核細(xì)胞和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的mRNA均具有與rRNA結(jié)合的SD序列，以利于進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。（× ）四不定項(xiàng)選擇題（3分/題，共15分）1. 下列生物體的細(xì)胞基因組哪些會有斷裂基因 （ AB ）A.動物 B.人 C.細(xì)菌 D.噬菌體2. 真核細(xì)胞基因表達(dá)的特點(diǎn)為 （ AD ）A.單順反子 B.多順反子 C.轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯連續(xù)進(jìn)行 D .轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯分開分步進(jìn)行3. 識別基因序列不同，但酶

5、切后產(chǎn)生的粘性末端相同的一類酶為 （ B ）A.同工酶 B.同尾酶 C.同裂酶 D.同位酶4. pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體應(yīng)有下列何種調(diào)控元件 （ ABD ）A.AmPr和Tetr B.ori復(fù)制子 C.LacZ標(biāo)記 D.多克隆位點(diǎn)5. 噬菌體外包裝目的基因片段的大小應(yīng)為 （ D ）A.小于噬菌體DNA的50% B. 小于噬菌體DNA的75%C.大于噬菌體DNA的105% D.為噬菌體DNA的75%105%五 問答題 （8分/題，共40分）1 真核細(xì)胞基因組中的基因常有內(nèi)含子存在，能否在原核細(xì)胞中表達(dá)？能，為什么？不能，為什么？不能，因?yàn)樵思?xì)胞缺乏對真核基因中內(nèi)含子的剪接功能和轉(zhuǎn)錄后加

6、工系統(tǒng)。原核生物必須有相應(yīng)的原核RNA聚合酶可識別原核細(xì)胞的啟動子, 以催化RNA的合成。 基因表達(dá)是以操縱子為單位，操縱子由數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控功能的部位組成的。因此在構(gòu)建原核表達(dá)載體時必須有1個強(qiáng)的原核啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列。2 質(zhì)粒單酶切點(diǎn)的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？目的基因片斷與載體由相同的單一限制性核酸內(nèi)切酶（如EcoRI）消化酶切后, 兩者的兩端均具有相同的粘性末端, 稱為單酶切點(diǎn)的粘性末端, 又稱全同源性粘性末端 高背景載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后, 載體分子易于自我環(huán)化, 既不利于目的基因的重組連接, 大大降低陽性克隆效率, 又可使非重組性載體

7、造成高背景。為了防止載體的自我環(huán)化，通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的5-P以抑制DNA的自我環(huán)化。在連接反應(yīng)中, 具有5-P，的目的基因DNA片斷可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA載體通過粘性末端發(fā)生互補(bǔ)連接, 盡管產(chǎn)生的重組DNA分子于連接點(diǎn)含有兩個缺口的開環(huán)分子,盡管在轉(zhuǎn)化時其轉(zhuǎn)化效率高于線性低于閉和環(huán), 但轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,在菌體內(nèi)其缺口可獲得修復(fù)。如第二章圖2-6 雙向插入經(jīng)單一限制核酸內(nèi)切酶（如EcoRI）切割的目的基因和載體, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在連接反應(yīng)中, 目的基因可發(fā)生雙向插入, 載體對目的基因表達(dá)是有方向的, 而目的基因可雙向與之相連, 這種連接若以克隆目的基因片段

8、為目的沒有影響, 若以表達(dá)為目的, 我們就要對插入的片段進(jìn)行方向鑒定, 因目的基因由起始密碼子向終止密碼子方向表達(dá)是定向轉(zhuǎn)錄的, 一旦啟動子與目的基因編碼順序方向相反就不能正確轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA。若構(gòu)建表達(dá)DNA重組體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組, 以便定向克隆。3 真核表達(dá)調(diào)控的順式作用元件有哪些？其作用特點(diǎn)是什么？順式作用元件為一些能與DBP結(jié)合的特定序列的DNA片段, 決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng),按功能可分為啟動子、增強(qiáng)子、沉默子、衰減子和終止子等DNA序列片段。 啟動子真核基因啟動子是基因表達(dá)時與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的5'

9、端DNA序列,包括在-30bp區(qū)富含有AT的典型TATA盒（框）（TATA box）和在-70-80bp區(qū)域（在TATA box上游）啟動元件。前者是引導(dǎo)RNA聚合酶在正確起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄mRNA所必需的DNA序列, 即保證轉(zhuǎn)錄的精確起始。后者UPE是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率和提高轉(zhuǎn)錄效率的調(diào)控序列，后者的序列常為GGTCAAT和GGGCCC序列, 稱為GC box, 它們經(jīng)協(xié)同作用,以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率。啟動子的轉(zhuǎn)錄效率因細(xì)胞而異，因此需要根據(jù)宿主細(xì)胞的類型選擇不同的啟動子，以便真核基因的高效表達(dá)。常用的啟動子有Rous肉瘤病毒啟動子RSV和巨細(xì)胞病毒的啟動子CMV。還有SV40早期啟動子, 腺病毒的晚

10、期啟動子。 增強(qiáng)子增強(qiáng)子是使啟動子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高（增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性）的一類順式作用元件，其本身不具有啟動子活性，是由多個獨(dú)立的，具有特征性的核苷酸序列所組成。其基本的核心組件常由812bp組成, 以單拷貝或多拷貝串聯(lián)的形式存在。增強(qiáng)子一般有以下特性：增強(qiáng)子能提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄的速率;增強(qiáng)子對同源或異源基因都有效; 增強(qiáng)子的位置可在基因5'上游、3'下游或內(nèi)部; 無方向性,增強(qiáng)子從5'3'或是從3'5'均可對啟動子發(fā)揮作用; 增強(qiáng)子可遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn); 增強(qiáng)子一般無基因特異性, 對各種基因啟動子均有作用, 但具有組織或細(xì)胞特異性。典型的

11、增強(qiáng)子首先發(fā)現(xiàn)于SV40的病毒中, 為SV40的早期基因增強(qiáng)子, 約200bp, 含2個72bp的重復(fù)序列, 位于早期啟動子上游, 增強(qiáng)子可促使病毒基因轉(zhuǎn)錄效率提高100倍，因此具有這一增強(qiáng)子的載體已得到了廣泛的應(yīng)用。近些年來，來自于Rous肉瘤病毒基因長末端重復(fù)序列和人類巨細(xì)胞病毒（CMV）增強(qiáng)子也已被廣泛用于真核細(xì)胞的基因表達(dá)。增強(qiáng)子能增強(qiáng)啟動子的轉(zhuǎn)錄能力，有效的增強(qiáng)子能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄達(dá)10倍或100倍以上, 在某些情況下, 表達(dá)產(chǎn)物可能具有細(xì)胞毒效應(yīng)。因此，最好使用一種可被外界刺激信號誘導(dǎo)表達(dá)外源基因的誘導(dǎo)型啟動子, 誘導(dǎo)型啟動子有熱休克啟動子、金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激和固醇類激素誘導(dǎo)的啟動

12、子，熱休克啟動子的誘導(dǎo)可通過提高細(xì)胞的培養(yǎng)溫度使啟動子轉(zhuǎn)錄水平提高，重金屬離子可有效地促進(jìn)金屬硫蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。 RNA剪接信號多數(shù)高等的真核基因都含有內(nèi)含子序列, 在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的前體mRNA要經(jīng)過剪接過程去掉內(nèi)含子順序后才成為成熟的mRNA分子。雖然許多基因的cDNA轉(zhuǎn)入哺乳類動物細(xì)胞后, 其表達(dá)不受有或無內(nèi)含子的影響, 但有些基因在真核細(xì)胞中表達(dá)需要有內(nèi)含子的存在。一般來說，在哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體中最好有一段內(nèi)含子序列的剪接信號， 以提供外源基因cDNA表達(dá)的需要。常用的內(nèi)含子剪接序列有SV40的小t抗原的內(nèi)含子序列等。 負(fù)調(diào)控元件沉默子和衰減子是抑制基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列,

13、稱為負(fù)調(diào)控元件, 它們與反式作用因子相互結(jié)合而起作用。這些負(fù)調(diào)控元件不受距離和方向的限制，并可對異源基因表達(dá)起作用。 終止子和polyA信號真核基因轉(zhuǎn)錄的確切終止信號和終止機(jī)制, 目前尚不清楚, 終止過程不是在RNA聚合酶指導(dǎo)下完成的, 在不明機(jī)制下發(fā)生轉(zhuǎn)錄終止?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)模板DNA分子的3'端有轉(zhuǎn)錄終止信號序列, 稱終止子。通常由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的具有polyA尾的基因終止信號是在多聚腺苷酸化位點(diǎn)下游的一段長度為數(shù)百個堿基的DNA區(qū)域內(nèi)的G/T簇, 例如在SV40中的AGGTTTTTT的DNA序列為終止轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。一般轉(zhuǎn)錄終止子為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列。現(xiàn)在基因工程表達(dá)載體上所使用的轉(zhuǎn)錄終

14、止子都是病毒基因或細(xì)胞基因的3'端的一段序列, 其中也包括3'端不翻譯區(qū)。如SV40小t抗原和-球蛋白的轉(zhuǎn)錄終止片段常用于構(gòu)建真核基因表達(dá)載體。一般認(rèn)為polyA的存在增加了mRNA分子的穩(wěn)定性,使之能成功地進(jìn)行翻譯。準(zhǔn)確而有效地進(jìn)行多聚腺苷酸化需要兩種序列：位于polyA位點(diǎn)下游的GU豐富區(qū)或U豐富區(qū); 位于polyA位點(diǎn)上游的1130個核苷酸處的一個由6個核苷酸組成的高度保守序列（5'-AAUAAA）, 這些序列與轉(zhuǎn)錄后的RNA切割和加尾有關(guān)。最常用的polyA信號是用SV40的一段237kb的BamHI-BcLI酶切片段, 它包含早期和晚期轉(zhuǎn)錄單位的切割和加pol

15、yA信號, 兩套信號分別位于不同的DNA鏈上, 作用方向相反, 它們對mRNA的加工都同樣有效。在雙啟動子的表達(dá)載體中，啟動子的轉(zhuǎn)錄方向?yàn)橥驎r，上游啟動的轉(zhuǎn)錄由于會穿過下游啟動子，這樣就使得下游的轉(zhuǎn)錄受到極大的影響，造成下游轉(zhuǎn)錄水平的下降，但是如果在兩個啟動子間插入一個轉(zhuǎn)錄終止子后，上游啟動子對下游啟動子的影響就被消除了，這樣下游啟動子的表達(dá)量會有明顯提高。當(dāng)兩個啟動轉(zhuǎn)錄方向相反時，基因表達(dá)可能會被轉(zhuǎn)錄形成的反義RNA所抑制, 這時插入轉(zhuǎn)錄終止子將會消除這種抑制作用。4 基因工程疫苗研究開發(fā)應(yīng)遵循的原則是什么？(1)不能或難于培養(yǎng)的的病原體如乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，戊型肝炎病毒(HEV)，EB病毒(Epstein-Barr病毒，EBV)，巨細(xì)胞病毒(CMV)，人乳頭瘤病毒(HPV)，麻風(fēng)桿菌，疾原蟲、血吸蟲等。(2)有潛在致癌性或免疫病理作用的病原體，前者如1型嗜人T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-I)，人免疫缺損病毒(HIV),單純皰疹病毒(HSV)，還有EBV、CMV、HPV等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革熱病毒(DGV)，腎綜合征出血熱病毒(HFRSV)；(3)常規(guī)疫苗免疫效果差，如霍亂和痢疾菌苗；或者反應(yīng)大，如百日咳和傷寒菌苗。(4)能大大節(jié)約成本，簡化免疫程序的多價疫苗，如以痘苗病毒，腺病毒，卡介苗或沙