如何理解測(cè)序蜂圖

1、測(cè)序峰圖測(cè)序方法現(xiàn)代DNA序列測(cè)序可分為一二三代。一代測(cè)序第一代測(cè)序技術(shù)包括鏈終止法和化學(xué)降解法，其主要特點(diǎn)是以待測(cè)DNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)規(guī)則采用DNA聚合酶體外合成新鏈。由于新鏈中滲入了帶有標(biāo)記的堿基類似物，可用于制備末端帶有標(biāo)記的DNA單鏈。這些末端帶有標(biāo)記的DNA單鏈?zhǔn)且粋€(gè)群體，在凝膠電泳時(shí)可以形成彼此僅差一個(gè)堿基的梯形條帶。根據(jù)末端堿基的特有標(biāo)記可以讀取待測(cè)DNA的序列組成。鏈終止法（Sanger法）反應(yīng)分別在4個(gè)試管中進(jìn)行，每一試管中都含有：1 .待測(cè)的DNA單鏈片段，作為模板；2 .DNA聚合酶；3 .序列已知且與模板3'端互補(bǔ)的引物；4 .四種脫氧核甘三磷酸（dATP

2、、dGTRdCTP和dTTP）;5 .四種雙脫氧核甘酸中的一種，作為DNA鏈合成的末端終止劑。在適當(dāng)條件下進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成，由于新?lián)饺氲暮烁仕嶂荒芡律?端的-OH連接，而2'3-雙脫氧核甘三磷酸核糖基的2'3位-OH的氧已脫掉，失去了和后來(lái)的核甘酸連接的可能性，這時(shí)堿基的摻入就有兩種可能性：1. dNTP摻入新生鏈，使鏈繼續(xù)延伸。2. 2'3'-ddNTP摻入，使新生鏈的合成終止。由于兩者摻入的幾率不同，就形成一套長(zhǎng)度不一的DNA片段。最后通過(guò)A、T、G和C四Isrictace-WCTGCCAGA-叫AIGAt嶗I.35JN8TAC80TuM4Product

3、sufRTreiacton的內(nèi)TACTATGCCAGA臣凱ATGA033ATGATftCQGTp組反應(yīng)的凝膠電泳放射自顯影圖譜，即可讀出所測(cè)樣品互補(bǔ)鏈的核甘酸序列。巧gimofthetourre箕l"伯Tube1PmuctsMreecioiiTemdsfe：-TACWGCXAGA-岡Q畫(271Tube2Productscrra3cttonTcrrXXiWTACTATCGCGA(24)ATg>ATGA1AU©(3G)ATGMAOJ©要求測(cè)序日t使用的DNA聚合酶不能有5'-3外切酶活性（可將新合成DNA鏈的5'-末端除去核甘酸而改變鏈的長(zhǎng)度）

4、、3'-5'外切酶活性（可將錯(cuò)配的堿基除去，再補(bǔ)上正確配對(duì)的核甘酸）。這兩種活性會(huì)產(chǎn)生干擾條帶。DNA聚合曲合成“NA引物I門4聚合髀s，T，5強(qiáng)機(jī)DNA5、3外切核隘防活性使DMA聚合懵可切除已存在的5'小鋪3*5即核酸胞活性可使DNA聚合常校正3'錯(cuò)配的核訐酸I-.-餡配的犢背翟iv安光染料標(biāo)記物在Sanger法中的應(yīng)用目前已發(fā)現(xiàn)具有不同熒光色彩的標(biāo)記化合物，可將其分別與指定的ddNTP結(jié)合，如ddATP標(biāo)記綠色熒光，ddCTP藍(lán)色熒光，ddTTP紅色熒光，ddGTP黑色熒光。這四種標(biāo)記的ddNTP混合加入到一個(gè)反應(yīng)中，聚合鏈終止反應(yīng)完成后，可以獲得末端分別

5、帶有A、CT和G的DNA單鏈。毛細(xì)管電泳帶電粒子在電場(chǎng)力的驅(qū)動(dòng)下，在毛細(xì)管中按其分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的電泳技術(shù)。樣品在電解液由冰動(dòng)，根據(jù)物質(zhì)的荷/質(zhì)比差異來(lái)進(jìn)行分離，比值愈大，跑得愈快lb)Elactrophonjeis:ACACCGTATCAT測(cè)序峰圖峰圖是以4種顏色連續(xù)的峰型圖代表A、T、G、C4種堿基序列的圖。峰的高低說(shuō)明了信號(hào)的強(qiáng)弱，寬窄表示的是分離效果，可以對(duì)比板膠電泳的亮度和條帶的寬窄。重疊則說(shuō)明了樣品中有長(zhǎng)度相同但是序列不同的片段。420430«5。，汕仆。GCAGGTTGTTTChTTCAi二信石丁ACGTGGG匚匚AGAGCftftAGGTAGG丁匚GA概

6、念:讀長(zhǎng)：序列讀取的堿基長(zhǎng)度，峰圖上方橫向顯示的數(shù)字。信號(hào)：測(cè)序序列是通過(guò)對(duì)不同堿基所攜帶的不同顏色的熒光信號(hào)翻譯所得，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱是我們常說(shuō)的信號(hào)。成功峰圖？峰型：尖銳、對(duì)稱、無(wú)底峰;讀長(zhǎng)：800bp可信；信號(hào)：正常（1k20k）,走勢(shì)平緩下降。測(cè)序峰圖中可能存在的問(wèn)題vi峰型問(wèn)題雙峰夾峰非單克隆雜合模板量高引物移碼結(jié)合問(wèn)題可信讀長(zhǎng)問(wèn)題起始序列不準(zhǔn)引物峰引物二聚體峰信號(hào)問(wèn)題寬峰膠有氣泡模板不純特定位置序列不準(zhǔn)底峰不干凈模板不純信號(hào)弱衰減或中斷弱或無(wú)模板和引物結(jié)合較弱模板和引物不結(jié)合雙峰非單克隆特征：從插入位點(diǎn)開(kāi)始雙峰或某個(gè)位置開(kāi)始雙峰處理方法：重新挑單克隆測(cè)序20例汕SOM8090TiCG

7、jTTCGiGCTCGGTACCCGGJlTCETCT£GG二丁TiTTTCi；Cii.匚GGGiCCiGCGCTTGCGGCTTGTGICCiTC雜合（突變）特征：峰圖中某些位置雙峰12013。1401501&017(11初CTGTTCaCCAiTTTTiCTIG*匚丁盤ACTGCAGTG4TTGA&CTTGGiTTiftTIAACAiG4ACA*TAFigure1SNP70fllD90100110120190GATAT£HGChGAATTCGC£CTTGTTTA&GGCCTAGCTAGCAGAATCCCTTGTTACTIACC1AlCF

8、igure2雜合缺失特征：從堿基缺失位置出現(xiàn)移碼。移碼底峰序列表現(xiàn)為主峰向左或向右移動(dòng)后的序時(shí)7o加90loonouino1T*TGGCGACiGCTTCATGCC4GTCTAAA*TCfcCiTTTATCGiTGCTGAC*iAGCTATTTTATTiCACCGCGCTTACCCCATTTTT'jGG.rTT7.'.TCTCTTTCT7AT7L"ATC'.：.r.'.,I.'.TTG；C.,.7TC；.：.TCG,-.T：-.S.：.T?!.：.：.7/.TGT'T.CT：.TTT"T.ATJI07：.T7-IlIII結(jié)合問(wèn)

9、題（JH）45C4fin加口5cm510=30引物問(wèn)題（YM）:引物合成不純或降解特征：序列一開(kāi)始就出現(xiàn)移碼現(xiàn)象處理方法：重新合成引物再測(cè)序特征：（1）一開(kāi)始就是雙峰，在某一點(diǎn)終止或從頭到尾雙峰可能原因：模板上有2個(gè)或2個(gè)以上以上引物結(jié)合位點(diǎn)、模板或引物不純處理方法：重新制備樣品或設(shè)計(jì)特異引物測(cè)序JHD-h二門''I1Ga:工AU二行r*TTCtrOgCHOCG>.rcGC1-T二Tr匚仁-TGi-13叱J.：72Dm?<gg_3«，匚CT哈丁亡仃,口JCAGIOCOT<2GA-i：GC丁，電*白夾峰：模板量高特征：峰圖中兩峰之間夾有小雜峰，一般不影

10、響主峰的讀取，在信號(hào)圖中表現(xiàn)為反應(yīng)信號(hào)過(guò)高。處理方法：直接或稀釋重跑，降低模板量測(cè)序130L0口J170JGATTC.i：CTTCGCCiTCGCTCTTCCTCCCCATATCTCGCATTTCACTGCTA|hjbaa?r3«hiia.q*plmfm*ipauqamn事二胃口串”事卜¥日；lvbi-aa»iriramd!«x-aqMbk?MLrada8hm*H>IHf2fV3H-IIJVE”3WVhsvlrFl，的！mraKM由事i寬峰可能原因：模板不純或POP7膠中有氣泡處理方法：重跑4時(shí)49LS0(S1052D53(540550lTCGCC

11、AASACCACGTTTTCGiGCTZGGCGAGCTC2GiA4TTITCiGCGGTGGTCCGGTGGC(；CTCACGGiAAiTTTfln底峰不干凈特征：信號(hào)圖中基線不齊或信號(hào)弱可能原因：模板純度不好，有雜質(zhì)；模板量偏低或反應(yīng)進(jìn)行不充分處理辦法：重新純化或重送樣；加量重做或重送樣MHII»用IK|AhATCACC<JiCA1C<-hi.t£rTA：iQA.k白4ttLtLJi*E匕iTC1LA11dF：kTCC：CG.1t,dIth*1引物峰及引物二聚體峰特征：在20-30、40-60bp堿基處有高信號(hào)的峰形成，之后信號(hào)可能衰減。處理方法：重新合成引

12、物或重新設(shè)計(jì)引物測(cè)序。引物形成二聚體致使反應(yīng)無(wú)信號(hào)7r-trfT"3博二。"&TCK,"ril*-!<-96*rwb!191-g4Cfci>nU4>tw-=不干擾峰（染料峰）和酒精峰特征：4個(gè)干擾峰固定出現(xiàn)在30、40、70、110bp附近處理方法：重新測(cè)序條料上輪住于k10G石展基工內(nèi),圖十普求才臺(tái)品酉才肯住住于200300將愛(ài)在之I旬,"透明白勺降解峰特征：在220、450bp附近G堿基降解，峰型擴(kuò)散。處理方法：若不影響堿基判讀不安排調(diào)整，否則安排重新測(cè)序?&0ArGTuaCGT7B7BOqHWTGTTTGTGTAT

13、TTGTG重復(fù)序列（CF）特征：?jiǎn)螇A基或兩個(gè)以上堿基重復(fù)出現(xiàn)，導(dǎo)致后續(xù)峰圖可能移碼或亂峰。處理方法：因重復(fù)未測(cè)到的序列，建議加測(cè)反向補(bǔ)拼理余的A】OrCJT4個(gè)HigDyc'1I1J.UJLULJUl'aUJ.taUIA1CC&GTGdOGI&GGCGGGGeLCCGGGGCGCTT&TGGOGTGiTCGGGGGGGGGGTTT270<260W903QQ310rTaTTattatTattattaTtattattattatTattattattat局GC(GC)特征：序列局部堿基GC富集，之后可能信號(hào)衰減，峰圖變亂。苧/叫iuv，土U1UIbiIbUTGCTGTGCCGCtCGCCGTCGCGGTGGCGCtCCTCGCGCifCGGCTTCGTGTCCICGGG£GCGTTtGGCGCGGCGC回文結(jié)構(gòu)及其他結(jié)構(gòu)（J0特征：信號(hào)衰減或中斷，峰圖變亂。處理方法：最好選用GC優(yōu)化程序無(wú)信號(hào)特征：峰圖表現(xiàn)為雜亂無(wú)章形成原因：引物和模板不能正常結(jié)合反應(yīng)，包括漏加，力口錯(cuò)，有影響結(jié)合或影響反應(yīng)因處理方法：菌液用通用引物測(cè)無(wú)信號(hào)的安排重新?lián)u菌、自帶引物無(wú)信號(hào)建議通用引物測(cè)序；質(zhì)粒、pcr測(cè)序無(wú)信號(hào)的不調(diào)整，建議客戶重新送樣，若失敗較多的挑幾個(gè)重測(cè)，并跟客戶說(shuō)明情況»J1010