高通量測(cè)序在臨床精準(zhǔn)診斷中的應(yīng)用

1、高通量測(cè)序（高通量測(cè)序（NGSNGS）在臨床）在臨床精準(zhǔn)診斷中的應(yīng)用精準(zhǔn)診斷中的應(yīng)用高通量測(cè)序成本迅速下降第一次人類基因組測(cè)序耗時(shí)13年，成本30億美元，到2008年11月，基因組測(cè)序僅需一兩周，花費(fèi)10萬美元。新一代儀器可將全基因組序列測(cè)序成本降到1000美元以下，成本不足第一代的百萬分之一。而且隨著技術(shù)進(jìn)步，仍在不斷下降。成本快速下降，測(cè)序領(lǐng)域的超摩爾定律助推臨床應(yīng)用測(cè)序設(shè)備發(fā)展現(xiàn)狀測(cè)序設(shè)備發(fā)展現(xiàn)狀3第一代（穩(wěn)定需求）第一代（穩(wěn)定需求）ABi3130 xL(FDA CFDA)3730 xL3500 xL（FDA CFDA）第三代第三代Life Technologies (ABi)Ion T

2、orrent PGMHelicos BiosciencesHelicos Genetic Analysis System Pacific BiosciencesRSSystem 第二代（高速發(fā)展）第二代（高速發(fā)展）RocheGenome Sequencer FLX System GS Junior System IlluminaGenome Analyzer IIxMiSeqHiSeq 1000HiSeq 2000HiSeq 2500Life Technologies (ABi)5500 SOLiD System5500 xL SOLiD SystemDanaherMotionPolonato

3、r G.007Complete Genomics無錫艾吉因生物信息技術(shù)有限公司無錫艾吉因生物信息技術(shù)有限公司AG-100深圳華因康基因科技有限公司（深圳華因康基因科技有限公司（CFDACFDA）Pstar-1中科院北京基因組所中科院北京基因組所/半導(dǎo)體所半導(dǎo)體所BIGIS-1BIGIS-4各類高通量測(cè)序技術(shù)原理各類高通量測(cè)序技術(shù)原理高通量測(cè)序技術(shù)在臨床中的主要應(yīng)用范圍高通量測(cè)序技術(shù)在臨床中的主要應(yīng)用范圍出生缺陷相關(guān)分子診斷中的應(yīng)用無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（NIPT）染色體畸變檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（CNV-seq）胚胎植入前遺傳學(xué)篩查領(lǐng)域中的應(yīng)用（PGS）腫瘤相關(guān)分子診斷中的應(yīng)用遺傳性腫瘤突變檢測(cè)（

4、Germ line）腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（Somatic）液態(tài)活檢（Liquid Biopsy）出生缺陷防治，任重而道遠(yuǎn)。出生缺陷防治，任重而道遠(yuǎn)。“ 據(jù)估計(jì)，目前我國出生缺陷發(fā)生率在5.6%左右,每年新增出生缺陷數(shù)約90萬例。出生缺陷不僅影響兒童的生命健康和生活質(zhì)量，而且影響整個(gè)國家人口素質(zhì)和人力資源的健康存量，影響經(jīng)濟(jì)社會(huì)的健康可持續(xù)發(fā)展?！?中國出生缺陷防治報(bào)告（2012）新生兒2000萬出生缺陷嬰兒100萬6染色體疾病10單基因疾病 3040多基因疾病11智力障礙2030各種畸形出生缺陷分為染色體疾病、單基因和多基因疾病NGS在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（NIPT）NIPTNIPT的科

5、學(xué)基礎(chǔ)的科學(xué)基礎(chǔ) 血漿游離胎盤血漿游離胎盤DNADNA胎兒游離DNA：cell-free fetal DNA（cffDNA）Lancet.1997胎盤來源母體外周血含有的cffDNA，幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。檢出時(shí)限懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。12無創(chuàng)取樣 - 抽血孕周范圍廣 12周到26周質(zhì)控容易 不依賴孕婦年齡孕周等因素、容易建立標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)規(guī)范不受上一胎影響NIPTNIPT相較臨床常見產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)相較臨床常見產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)多國出臺(tái)多國出臺(tái)NIPTNIPT指南指南國際專業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)表NIPT指導(dǎo)意見美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（ ACOG）和美國母胎醫(yī)學(xué)會(huì)（SMFM）美國遺傳學(xué)

6、咨詢協(xié)會(huì)（NSGC）國際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)（ISUOG）國際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)（ISPD）加拿大婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)（SOGC）美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）意大利母胎醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì) 美國都是CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）認(rèn)證機(jī)制，無FDA批準(zhǔn)公司 ACAOG 201506262015.1.15 衛(wèi)計(jì)委婦幼司衛(wèi)計(jì)委婦幼司我國我國NIPTNIPT臨床應(yīng)用政策法規(guī)臨床應(yīng)用政策法規(guī)目的：目的： 完善技術(shù)規(guī)范 明確在孕產(chǎn)婦人群中的適用范圍 界定其在整體產(chǎn)前篩查與診斷服務(wù)體系中的合理定位 規(guī)范服務(wù)流程 提高服務(wù)質(zhì)量和管理水平 高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查與

7、診斷技術(shù)規(guī)范（試行）NIPTNIPT的臨床質(zhì)量控制的臨床質(zhì)量控制21三體綜合征99%18三體綜合征97%13三體綜合征90% 檢出率復(fù)合假陽性率不高于0.5% 假陽性率復(fù)合陽性預(yù)測(cè)值不低于50% 陽性預(yù)測(cè)值復(fù)合假陰性率約為0.3% 假陰性率胎盤/胎兒染色體結(jié)構(gòu)差異（也叫局限性胎盤嵌合，cpm）現(xiàn)象是由于發(fā)育造成的，機(jī)制主要是受精卵發(fā)育早期的染色體糾正，在正常孕婦群體里發(fā)生率約千分之1-5，是nipt假陽性發(fā)生的主要原因。這種現(xiàn)象在生殖領(lǐng)域（pgs）也存在，具體指囊胚活檢樣本與其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)染色體結(jié)構(gòu)不一致，發(fā)生比例要比孕期cpm高，大概1-10%，因?yàn)檠芯侩y度較大，具體數(shù)字還沒有共識(shí)。NIPTNI

8、PT的未來發(fā)展空間大的未來發(fā)展空間大測(cè)序深度染色體非整倍體 唐氏綜合征、愛德華氏綜合征、等染色體微缺失微重復(fù)綜合征 Digeorge綜合征、貓叫綜合征、等單基因病 耳聾、地中海貧血、苯丙酮尿癥、等AAGCTTGCGACTTCAGTTAGCGCTAAGCCAGTGCATGNGS在染色體畸變檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（CNV-seq）CNV-SeqCNV-Seq應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域 流產(chǎn)原因查找 產(chǎn)前（羊水、臍血）檢測(cè) 不孕不育原因查找 染色體疾病先證者的染色體異常檢測(cè)CNV-SeqCNV-Seq技術(shù)操作流程技術(shù)操作流程CNV-SeqCNV-Seq針對(duì)的人群針對(duì)的人群產(chǎn)前診斷： 具有染色體疾病家族病史的夫婦 死

9、胎、反復(fù)性流產(chǎn)，需要查明原因的夫婦 曾經(jīng)生育有出生缺陷患兒的孕婦 染色體核型分析結(jié)果為正常，但超聲顯示結(jié)構(gòu)異常的胎兒及其父母 胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩先證者遺傳病診斷： 染色體核型分析正常，但臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力低下、自閉、各種畸形、生育障礙等的患者及其父母 其他醫(yī)學(xué)檢測(cè)為染色體疾病，需要確診的患者NGS在胚胎植入前遺傳學(xué)篩查中的應(yīng)用（PGS)PGSPGS臨床流程臨床流程檢測(cè)內(nèi)容：檢測(cè)內(nèi)容： 全部染色體非整倍體 大于4Mb的新發(fā)的染色體微缺失/微重復(fù) 大于1Mb的遺傳自父母的染色體微缺失/微重復(fù)使用使用范圍范圍: : 高齡患者（35歲） 有反復(fù)流產(chǎn)史的患者（自然流產(chǎn)3次） 反復(fù)胚胎種植失敗的患者（

10、失敗3次） 生育過染色體異?；純旱姆驄D 自身染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的夫婦 嚴(yán)重的男性不育（SMF），少弱精子癥、畸精癥 自愿接受胚胎染色體異常排查的夫婦PGS檢測(cè)內(nèi)容及適用范圍對(duì)對(duì)NGSNGS在在PGSPGS應(yīng)用的思考應(yīng)用的思考高靈敏NGS技術(shù)的測(cè)序環(huán)境防污染系統(tǒng)的建立 單細(xì)胞測(cè)序 操作者脫落細(xì)胞的污染？樣本與植入物的一致性問題 胎盤/胎兒染色體結(jié)構(gòu)差異（也叫局限性胎盤嵌合，cpm）現(xiàn)象在生殖領(lǐng)域（PGS）也存在，具體指囊胚活檢樣本與其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)染色體結(jié)構(gòu)不一致，發(fā)生比例大概1-10%，因?yàn)檠芯侩y度較大，具體數(shù)字還沒有共識(shí)。注冊(cè)審批的難度 1)國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制 2)臨床試驗(yàn)的難點(diǎn)?NGSNGS在腫

11、瘤分子診斷中的應(yīng)用在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用*每每1010萬人發(fā)病人數(shù)萬人發(fā)病人數(shù) * * *每每1010萬人死亡人數(shù)萬人死亡人數(shù)數(shù)據(jù)來源：全國腫瘤登記中心的數(shù)據(jù)來源：全國腫瘤登記中心的20122012中國腫瘤登記年報(bào)中國腫瘤登記年報(bào)前十大腫瘤發(fā)病占腫瘤整體發(fā)病比例76.39%前十大腫瘤死亡占腫瘤整體發(fā)病比例84.27%發(fā)病率*每年新發(fā)3,120,000人死亡率*每年死亡2,700,000人肺癌，肺癌，5454人人胃癌，胃癌，3636人人結(jié)直腸癌，結(jié)直腸癌，2929人人肝癌，肝癌，2929人人食管癌，食管癌，2222人人乳腺癌，乳腺癌，2121人人胰腺癌，胰腺癌，7 7人人淋巴癌，淋巴癌，7 7人

12、人膀胱癌，膀胱癌，7 7人人甲狀腺癌，甲狀腺癌，7 7人人肺癌，肺癌，4646人人肝癌，肝癌，2626人人胃癌，胃癌，2626人人食管癌，食管癌，1717人人結(jié)直腸癌，結(jié)直腸癌，1414人人胰腺癌，胰腺癌，7 7人人乳腺癌，乳腺癌，5 5人人白血病，白血病，4 4人人腦癌，腦癌，4 4人人淋巴癌，淋巴癌，4 4人人多種臨床腫瘤分子診斷需求多種臨床腫瘤分子診斷需求全面的基因檢測(cè)多種樣本類型可進(jìn)行療效監(jiān)測(cè) 靶向用藥相關(guān)基因 化療用藥相關(guān)基因 腫瘤易感性相關(guān)基因檢測(cè) 腫瘤發(fā)生相關(guān)基因檢測(cè) 血液樣本 小標(biāo)本組織樣本 大標(biāo)本組織樣本 準(zhǔn)確定量遺傳性腫瘤突變檢測(cè)（遺傳性腫瘤突變檢測(cè)（GermGerm li

13、neline）臨床應(yīng)用：臨床應(yīng)用：檢測(cè)多種腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)；檢測(cè)腫瘤基因型，判定家系成員患病風(fēng)險(xiǎn)；指導(dǎo)腫瘤個(gè)性化治療?？蒲袘?yīng)用科研應(yīng)用快速、低成本的探索腫瘤相關(guān)基因的突變；若采用毛細(xì)管測(cè)序的技術(shù)，一次只能檢測(cè)一條DNA片段，需要大量人力，成本高，且需要大量DNA樣本。、茱莉 BRCA1陽性針對(duì)腫瘤基因外顯子或SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行NGS檢測(cè)。腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（SomaticSomatic）Industry GuidelinesEmerging and Clinical Trials 指導(dǎo)腫瘤的個(gè)體化治療 很多腫瘤患者無法進(jìn)行活檢或手術(shù)；很多腫瘤患者無法進(jìn)行活檢或手術(shù)；

14、 穿刺受檢者嚴(yán)重不適感；穿刺受檢者嚴(yán)重不適感； 穿刺自身的臨床風(fēng)險(xiǎn)；穿刺自身的臨床風(fēng)險(xiǎn)； 取材時(shí)間點(diǎn)受限，很難進(jìn)行多次取樣；取材時(shí)間點(diǎn)受限，很難進(jìn)行多次取樣； 腫瘤異質(zhì)性。腫瘤異質(zhì)性?；诮M織的腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)的局限性基于組織的腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)的局限性液態(tài)活檢液態(tài)活檢(Liquid Biopsy)(Liquid Biopsy)Speicher M R, Pantel K. Tumor signatures in the bloodJ. Nature biotechnology, 2014, 32(5): 441-443. 循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (Circulating tumor ce

15、lls, CTCs)(Circulating tumor cells, CTCs) 游離腫瘤游離腫瘤DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA)DNA (Circulating tumor DNA, ctDNA)目前看，目前看，ctDNActDNA更適合做液態(tài)活檢更適合做液態(tài)活檢作為無法獲取組織標(biāo)本的補(bǔ)充，無創(chuàng)取樣后的檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，預(yù)測(cè)耐藥及復(fù)發(fā) 提高全程管理水平指導(dǎo)用藥指導(dǎo)用藥實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)循環(huán)而勻質(zhì)的血液標(biāo)本，在一定程度有效克服異質(zhì)性勻質(zhì)標(biāo)本勻質(zhì)標(biāo)本未來可用未來可用ctDNA血液檢測(cè)血液檢測(cè)進(jìn)行突變狀態(tài)的動(dòng)態(tài)耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)進(jìn)行突變狀態(tài)的動(dòng)態(tài)耐

16、藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè) 腫瘤類型繁多，分子突變特點(diǎn)不一；腫瘤類型繁多，分子突變特點(diǎn)不一； 高靈敏度定性、定量檢測(cè)，技術(shù)分辨率要求高；高靈敏度定性、定量檢測(cè)，技術(shù)分辨率要求高； ctDNActDNA來源復(fù)雜，不同腫瘤患者個(gè)體差異較大，數(shù)據(jù)解讀與注釋來源復(fù)雜，不同腫瘤患者個(gè)體差異較大，數(shù)據(jù)解讀與注釋需謹(jǐn)慎；需謹(jǐn)慎； 目前仍局限于晚期腫瘤的臨床應(yīng)用；目前仍局限于晚期腫瘤的臨床應(yīng)用； 需要大規(guī)模、多中心臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)。需要大規(guī)模、多中心臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)。ctDNActDNA檢測(cè)技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)檢測(cè)技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)對(duì)對(duì)NGSNGS在腫瘤應(yīng)用的思考在腫瘤應(yīng)用的思考腫瘤風(fēng)險(xiǎn)易感基因檢測(cè)對(duì)診斷的價(jià)值？ 數(shù)據(jù)庫的積累？預(yù)測(cè)的精準(zhǔn)性？ 23and me？2013年11月26日，F(xiàn)DA叫停 健康基因檢測(cè)服務(wù)。 2015年3月：批準(zhǔn)其布盧姆綜合癥基因攜帶者檢測(cè)服務(wù)(一種隱性遺傳病)。 BRCA1、BRCA2-乳腺癌易