食品免疫學(xué)免疫檢測技術(shù)與食品安全檢測

1、第八章 免疫學(xué)技術(shù) 第一節(jié) 抗原抗體的制備一、抗原的制備制備特異性的抗原是制的合格抗體的前提條件，而作為檢測診斷的抗原也必須是純化的抗原。抗原的物質(zhì)很多，很少是單一成分，必須從復(fù)雜的組分中提取分離。按抗原的物理狀態(tài)，可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原三類。1、天然抗原的制備（1）顆粒性天然抗原常見的顆?？乖▌游?、植物、微生物的細(xì)胞，和有關(guān)的細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞的細(xì)胞壁、線粒體，細(xì)菌的鞭毛和菌毛等。一般步驟為：首先收集抗原細(xì)胞或（和）擴增培養(yǎng)，然后離心或過濾收集細(xì)胞或細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)物，再進(jìn)行病原微生物滅活。（2）可溶性抗原的分離純化蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補體、細(xì)菌毒素、免疫球蛋白片段、核

2、酸等皆為良好的可溶性抗原，免疫前常需純化。 細(xì)胞破碎方法有：凍融法；超聲破碎；高速組織搗碎機法；研磨法；溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶處理 可溶性蛋白抗原的分離方法：離心分離法：差速離心、密度梯度離心選擇沉淀法：鹽析沉淀法；有機溶劑沉淀法，常采用乙醇或丙酮核酸去除法，DNA酶、RNA酶處理；水溶性非離子型聚合物沉淀法：常用非離子型聚合物為分子量為20006000的聚乙二醇（PEG）凝膠過濾法 ：又稱分子篩層析。通過凝膠分子篩作用，可將大、中、小三類分子分開，選擇凝膠柱時應(yīng)注意選用適于分離范圍內(nèi)的凝膠。 離子交換層析法：離子交換層析是利用一些帶電離子基團(tuán)的凝膠或纖維素吸附帶有相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。親和

3、層析法：親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。如抗原和抗體、酶和酶抑制物、酶蛋白和輔酶、激素和受體、DNA和RNA等之間有特殊親和力，一定條件下，兩者可緊密結(jié)合成復(fù)合物，如將復(fù)合物的一方固定于固相載體上，則可從溶液中分離和提純另一方。 純化抗原的鑒定 主要對純化抗原的含量、理化性質(zhì)、純度及免疫活性進(jìn)行鑒定，常用方法有酚試劑法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫電泳法、免疫雙擴散法等。2、人工抗原的制備人工抗原指經(jīng)過人工修飾的半抗原，即將半抗原與載體連接后形成的完全抗原。小分子半抗原可以是多糖、多肽、核酸、類固醇激素、某些藥物及其它化學(xué)物品。在食品檢驗中常見的小分子半抗原有各種農(nóng)

4、藥、獸藥、添加劑與非法添加物（鹽酸克倫特羅）、真菌毒素等等。常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。蛋白質(zhì)：常用牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、卵清白蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA)。 多肽聚合物：常用多聚賴氨酸。 大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入弗氏佐劑課產(chǎn)生良好的抗體。連接方法：物理法 是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；化學(xué)法 是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到蛋白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選

5、用不同的方法進(jìn)行連接。根據(jù)半抗原擁有的化學(xué)基團(tuán)不同，連接方法主要有以下幾類：帶游離氨基或羧基以及二種基團(tuán)皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛拍芘c載體連接。帶有酚基的半抗原：可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。3、免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為佐劑(adjuvant) 。 應(yīng)用

6、最多的佐劑為福氏佐劑福氏不完全：石蠟油+羊毛脂福氏完全：石蠟油+羊毛脂+卡介苗乳劑的制備：乳劑：抗原與佐劑的混合物抗原與佐劑的比例為1:1，注射前要充分乳化二、多克隆抗體的制備1、免疫動物的選擇選擇動物時應(yīng)考慮以下因素：ü 抗原來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。ü 動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；ü 抗體的用途和量：抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。2、免疫方法選定動物后，在免疫過程

7、中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。痹。（1） 免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。小鼠首次劑量50-400 ug/次。大鼠：100-1000 ug/次。兔子：200-1000 ug/次。加強免疫劑量為首次劑量的1/5-2/5。（2） 免疫途徑與免疫間隔時間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。 免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以23周為佳，二次后間隔時間一般為1周，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不

8、高。 3、動物采血采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達(dá)到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。 (1) 頸動脈采血法 (2) 心臟采血法 (3) 靜脈采血法4、免疫血清的鑒定（1） 效價的測定 效價，又叫滴度，是稀釋度的倒數(shù)，指通過血清學(xué)方法能顯示一定反應(yīng)的抗體或抗血清的最高稀釋倍數(shù)，如終點稀釋度為1/100，效價 (每1ml的血清中抗體效價)為100抗體單位。顆粒性抗原可采用凝集試驗。 可溶性抗原常用雙向免疫擴散試驗、ELISA等方法。（2）特異性的鑒定 抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴散法、免疫電泳法。（3） 純度的鑒定 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳

9、（SDS-PAGE）、雙向擴散試驗、免疫電泳等方法。（4） 親和力的鑒定 抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強度。 測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗等。5、免疫血清的保存 （1）4保存（6個月）（2）低溫保存（-70 -20 ，5年）（3）真空干燥保存（5 10年）注意點：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復(fù)凍融（分裝）三、單克隆抗體的制備單抗：由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。單抗制備過程1、致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備3、飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備4、細(xì)胞融合5、選擇性培養(yǎng)6、特異性抗體的檢測7、雜交瘤細(xì)胞的克隆化8、雜交瘤

10、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇9、單克隆抗體的大量制取10、單克隆抗體的純化第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)抗原-抗體反應(yīng)（antigen-antibody reaction）是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合的反應(yīng)。 血清學(xué)反應(yīng)（serological reaction）指體外的抗原-抗體反應(yīng)。一、抗原抗體反應(yīng)的原理（1）抗原抗體親和力靜電引力（electrostatic forces）范德華引力:作用最?。╲an der Waals interactions）氫鍵:最具特異性（hydrogen bond ）疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions） （2）抗原抗體親水膠體

11、轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗體、大多數(shù)抗原亦為蛋白質(zhì)，在水中皆為膠體溶液，不會發(fā)生自然沉淀。抗原抗體結(jié)合使電荷減少或消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。如再加入電解質(zhì)，則進(jìn)一步使疏水膠體物相互靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物。二、抗原-抗體反應(yīng)特點1、特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型的互補。2、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性 影響因素： 抗體對相應(yīng)抗原的親和力親和力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對復(fù)合物的影響pH、離子強度 3、比例性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比

12、關(guān)系前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適4、階段性 第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見。 第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、 沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。 三、抗原-抗體反應(yīng)類型 反應(yīng)類型實驗技術(shù)非標(biāo)記凝集反應(yīng)直接凝集試驗、間接凝集試驗、間接抑制凝集試驗、協(xié)同凝集試驗沉淀反應(yīng)液相內(nèi)凝集試驗、凝膠內(nèi)凝集試驗補體參與的反應(yīng)補體溶血試驗、補體結(jié)合試驗中和反應(yīng)病毒中和試驗、毒素中和試驗標(biāo)記標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)第三節(jié) 非標(biāo)記免疫分析技術(shù) 一、凝集反應(yīng)

13、（agglutination）細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成肉眼可見的凝集塊現(xiàn)象，稱為凝聚反應(yīng)。用于凝集反應(yīng)中的抗原稱凝集原(agglutinogen)。用于凝集反應(yīng)中的抗體稱凝集素（agglutinin)。1. 直接凝集反應(yīng)顆粒抗原與抗體直接結(jié)合玻片法：細(xì)菌及ABO血型鑒定試管法：2. 間接凝集反應(yīng) 抗原（或抗體）吸附于載體+相應(yīng)抗體（或抗原）凝集 常用載體：乳膠顆粒、羊紅細(xì)胞二、沉淀反應(yīng)(precipitation) 沉淀反應(yīng)指可溶性抗原與其相應(yīng)的抗體在合適條件下反應(yīng)并出現(xiàn)沉淀物的現(xiàn)象。 用于沉淀反應(yīng)中的抗原稱沉淀原(precipitonogen)。 用于沉淀反應(yīng)中的抗體稱沉

14、淀素（precipitin) 。 1. 液相內(nèi)沉淀環(huán)狀沉淀反應(yīng)：小試管內(nèi)，下層沉淀素與上層沉淀原在界面應(yīng)，形成白色沉淀環(huán)。絮狀沉淀反應(yīng)：抗原抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在下，兩者結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。2. 凝膠內(nèi)沉淀（1）單向瓊脂擴散試驗 是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴散?？乖跀U散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量（2）雙向免疫擴散 是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種

15、以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性 、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。（3）對流免疫電泳是先將待側(cè)血清標(biāo)本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。（4） 火箭電泳 將單向免疫擴散與電泳技術(shù)結(jié)合，可快速測定標(biāo)本中可溶性抗原的含量。（5）免疫比濁法 該技術(shù)是利用抗原抗體復(fù)合物在液相中形成濁度來測量抗原含量的方法。方法：ü 透射光比濁法ü 散射光比濁法

16、52; 免疫乳膠比濁法ü 速率抑制免疫比濁法三、補體參加的反應(yīng)此類反應(yīng)是利用抗體與紅細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合后，使反應(yīng)體系中補體激活導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象建立的。是在補體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)，來檢測未知的抗原或抗體的血清學(xué)試驗。四、中和試驗（病毒、毒素）原理：病毒、細(xì)菌、毒素與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，喪失生物活性。用途：1. 用已知血清鑒定病毒、細(xì)菌、毒素、獸藥殘留等。2. 用已知病毒、細(xì)菌檢測血清抗體測定抗體免疫血清效價（中和價）。第四節(jié) 免疫標(biāo)記分析技術(shù)用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)l 抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，定位、定量、定性測定。l 標(biāo)記物：熒光素、酶、

17、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、膠體金等。l 類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)等。一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 用酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)常用的酶：辣根過氧化酶、堿性磷酸酶 常用底物：鄰苯二胺（OPD）ü 用酶標(biāo)記Ab(或Ag)與標(biāo)本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合。ü 加入酶的底物，在酶作用下產(chǎn)生有色物質(zhì),ü 根據(jù)顏色可作出判斷或測量光密度值。二、免疫熒光法(異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白) v 直接法 ：用已知熒光標(biāo)記的抗體檢測未知抗原。v 間接法： 用熒光標(biāo)記的抗抗

18、體，檢測未知的抗原/抗體。v 補體法：三、放射免疫法v 將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來的技術(shù)，測定激素和藥物。v 常用I125和I131v 快速，敏感（pg)，但污染環(huán)境，有一定的危害性。四、免疫膠體金技術(shù)v Immunological colloidal gold signaturev 是用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，用以檢測未知抗原或抗體的技術(shù)，可用于多種液相免疫測定和固相免疫分析。v 免疫層析法：immunochromatography五、化學(xué)發(fā)光免疫分析v Chemiluminescence immunoassayv 標(biāo)記物：魯米諾等。v 是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。六、免疫印跡法（Western blotting)v 先將抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳分開，再將分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，然后放入含有抗體的溶液中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。第五節(jié) 免疫細(xì)胞及其功能檢測檢測各群體淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標(biāo)本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本