葉綠體轉(zhuǎn)基因方法

1、葉綠體轉(zhuǎn)基因方法，超表達(dá)和純化人血清白蛋白，蛋白質(zhì)很容易受到蛋白降解艾麗西亞費(fèi)爾南德斯-圣米1,天使明戈卡斯特2,邁克爾米勒3,和亨利丹尼爾1,*分子生物學(xué)的佛羅里達(dá)州中部，生物分子大學(xué)1系和微生物學(xué)，科學(xué)方婁#20,336室，奧蘭多，佛羅里達(dá)州32816-2360,USA農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和自然資源的納瓦拉，CSIC的公立大學(xué)2研究所，Mutilva巴哈31192西班牙納瓦拉3奧本大學(xué)研究儀器設(shè)備-先進(jìn)的顯微及成像實(shí)驗(yàn)室，赤褐色，AL36849,USA概要人血清白蛋白（HSA）占血清中總蛋白的60%,它是最廣泛使用的靜脈內(nèi)的蛋白質(zhì)中的一些人的療法。HSA,但是，目前提取的只有從血液因?yàn)槿狈ι虡I(yè)上可

2、行的重組表達(dá)的系統(tǒng)。HSA是高度敏感蛋白水解降解在重組系統(tǒng)和是昂貴的凈化。HSA使用的Shine-Dalgarno順序在轉(zhuǎn)基因葉綠體表達(dá)（SD）,這通常有利于超表達(dá)轉(zhuǎn)基因，導(dǎo)致在僅在0.02%的HSA總蛋白（TP）。使用葉綠體非翻譯HSA調(diào)節(jié)序列的修飾區(qū)（UTR）導(dǎo)致了過度表達(dá)的HSA（最高達(dá)11.1%,TP）的，補(bǔ)償過度蛋白水解降解。這是藥物蛋白在轉(zhuǎn)基因表達(dá)最高植物和500倍高于轉(zhuǎn)基因葉子HSA表達(dá)以前的報(bào)告。電子對免疫標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因葉綠體的顯微照片顯示HSA包涵體，這提供了用于從其它細(xì)胞蛋白純化的簡單方法。HSA包容機(jī)構(gòu)可以很容易地溶解，以便獲得用適當(dāng)?shù)脑噭┮詥误w形式。該在這項(xiàng)研究中使用的調(diào)

3、節(jié)元件應(yīng)作為一個(gè)模型系統(tǒng)用于增強(qiáng)的表達(dá)外源蛋白是高度敏感的蛋白水解降解，并提供在優(yōu)勢純化，包涵體形成的時(shí)候。關(guān)鍵詞葉綠體基因工程；生物制藥；轉(zhuǎn)基因作物；分子農(nóng)業(yè);重組人血蛋白介紹可用性重組人蛋白發(fā)生了革命性的使用治療寶貴的蛋白質(zhì)在臨床醫(yī)學(xué)。植物提供了一個(gè)合適的替代微生物或因?yàn)樗鼈兊膬r(jià)格低廉的生產(chǎn)生物藥物蛋白質(zhì)的動物表達(dá)成本和不存在的人類病原體。但是，也有一定的局限性。尤其是，?2003Blackwell出版有限公司*通訊（傳真）。美國國立衛(wèi)生研究院公共訪問作者手稿植物生物工程學(xué)家作者的手稿；可在PMC2012年10月26發(fā)表在最后

4、的編輯形式：植物生物工程學(xué)家2003年3月；1（2）:71-79。DOI:10.1046/j.1467-7652.2003.00008.x。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿核轉(zhuǎn)基因植物的人類蛋白質(zhì)的表達(dá)已經(jīng)低得令人失望，例如：人血清白蛋白的總可溶性蛋白（TSB白00.02%,人干擾素30.000017%鮮重，人表皮生長因子茶匙和促紅細(xì)胞生成素0.0026%0.001%茶匙（丹尼爾等，2001D）。因此，為了增加在表達(dá)水平是很重要為了利用植物生產(chǎn)藥用重要的蛋白質(zhì)。作為替代核表達(dá)，葉綠體轉(zhuǎn)基因的方法已經(jīng)開發(fā)作為有效的工具，生物制藥的蛋白質(zhì)在植物中的表達(dá)（丹尼爾和Dhin

5、gra,2002;丹尼爾等人，2001年，B;DeGray等人，2001;阿骨打等人，2000;的Staub等人，2000）?；诟叻肿拥鞍踪|(zhì)的表達(dá)與第一示范后，多樣的醫(yī)療應(yīng)用（阿骨打等人，2000）,轉(zhuǎn)基因葉綠體已經(jīng)顯示快遞非常小的抗菌肽沒有融合蛋白（DeGray等人。，2001）,裝配官能低聚物與霍亂毒素3亞單位的二硫鍵（丹尼爾等人，2001年b）,和表達(dá)的單克隆抗體與協(xié)同表達(dá)和裝配的重和輕鏈與正確折疊和形成二硫橋的（丹尼爾等人，2001年），這表明適當(dāng)?shù)难趸€原環(huán)境或需要伴侶蛋白是本在葉綠體中。功能的人類生長激素在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)葉綠體證實(shí)葉綠體能夠人類蛋白的正確折疊的用二硫鍵（的St

6、aub等人，2000）。表達(dá)多基因在一個(gè)單一的能力轉(zhuǎn)化事件（丹尼爾和Dhingra,2002;德小筑等，2001）,積累非常大量的外來蛋白質(zhì)（德小筑等，2001）,成功番茄有色體用于水果高水平轉(zhuǎn)基因表達(dá)的工程（聯(lián)陣等人，2001年），其耦合到超表達(dá)疫苗抗原（丹尼爾。等，2001年b）,以及使用植物來源的無抗生素選擇標(biāo)記（丹尼爾等人，2001年c）,好兆頭口服交貨可食用疫苗和生物制藥是目前鞭長莫及那些誰最需要它們。此外，葉綠體基因工程是一個(gè)環(huán)保的方式，提供了轉(zhuǎn)基因的遏制和解決基因沉默和核轉(zhuǎn)基因植物（Bogorad,2000遇到位置效應(yīng)；丹尼爾和Dhingra,2002;丹尼爾等人，2002年;丹

7、尼爾，2002）。HSA是最廣泛使用的靜脈內(nèi)蛋白質(zhì)和被規(guī)定在multigram數(shù)量在創(chuàng)傷和其它各種臨床情況（彼得斯，1995年），以取代血容量。HSA是單體球狀前原蛋白，其成熟形式由一個(gè)單一的585個(gè)氨基酸的多肽鏈（66.5kDa的17個(gè)二硫鍵）。每年世界需要超過500噸占超過$1.5十億市值。至今，白蛋白已經(jīng)主要生產(chǎn)的血清的分儲。缺乏糖基化有助于生產(chǎn)官能的HSA原核系統(tǒng)中。雖然HSA基因和cDNA已被表達(dá)在多種微生物系統(tǒng)，其中包括大腸桿菌（拉塔等人，1987）,枯草芽抱桿菌（Saunders等人，1987）,釀酒酵母（夸克等人，1989）,克魯維（冷嘲熱諷等人，1991）或畢赤酵母（大谷等人

8、，1998）,沒有系統(tǒng)尚未商業(yè)上可行的。Sijmons等人。（1990）取得的第一報(bào)告試圖表達(dá)HSA在轉(zhuǎn)基因植物，但非常低的表達(dá)水平達(dá)到（0.02%TSB。HSA無法檢測，如果在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，提示該蛋白質(zhì)在該隔室并不穩(wěn)定，由于高敏感性的蛋白水解降解。有10倍增加的HSA累積已經(jīng)最近報(bào)道通過核馬鈴薯植物的轉(zhuǎn)化和靶向于HSA的塊莖質(zhì)外體（法倫等。，2002年）。估計(jì)行業(yè)，然而，表明具有成本效益的產(chǎn)量藥品生產(chǎn)是每克鮮重0.1毫克的HSA（法倫等人，2002）。此外，良好的重組系統(tǒng)中仍然沒有可用的許多人類蛋白質(zhì)是昂貴的純化或高度易感對蛋白水解降解。已知的是傳統(tǒng)使用的列生物藥品的純化占30%生產(chǎn)成本和的

9、設(shè)置成本的70%（佩德里迪斯等人，1995）。蛋白水解降解文瀾等。第2頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿；可在PMC201210月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿另一個(gè)嚴(yán)重的問題，工業(yè)生物處理。日益增加的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的在通過使用重組DNA技術(shù)的異源宿主帶來這問題成為關(guān)注的焦點(diǎn)；異源蛋白顯得更容易蛋白水解（Enfors,1992年）。重組蛋白質(zhì)通常通過細(xì)胞視為外國，因此降低比大多數(shù)內(nèi)源性蛋白（Rozkov等人，2000）要快得多。的蛋白水解穩(wěn)定性重組蛋白是影響最終產(chǎn)量一個(gè)顯著因子。本研究試圖開發(fā)重組體HSA的生產(chǎn)更有效的方法，其可以用作模型系統(tǒng)，以豐富或純化來自生物制

10、藥蛋白轉(zhuǎn)基因植物，這是高度敏感的蛋白水解降解。結(jié)果與討論兩個(gè)葉綠體轉(zhuǎn)化載體被設(shè)計(jì)具有不同5'調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)HSA表達(dá)和轉(zhuǎn)基因最大化蛋白積累葉綠體。PLD的基本載體，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)室葉綠體轉(zhuǎn)化開發(fā)，使用（丹尼爾等人，1998;丹尼爾等人，2001年b;德科薩等人，2001;阿骨打等人，2000;哥打等人，1999）。在質(zhì)粒pLDAsdHSA（圖1a）,所述的aadA基因，其賦予壯觀霉素抗性，和HSA的基因被表達(dá)為從質(zhì)多順反子Prrn啟動子。閃耀-達(dá)爾加諾（SD）共有序列GGAGG放在上游的兩個(gè)基因。葉綠體高水平的外源蛋白的表達(dá)（TSP的3-21%）有研究表明，使用該5'序列不同的蛋白質(zhì)

11、（丹尼爾等人，2001年b;DeGray等人，2001;哥打等人，1999）。在pLDApsbAHSA向量（圖1a）,在204bp的煙草插入含有啟動子和體psbA5'UTR葉綠體DNA片段立即于HSA編碼序列的上游并且所述的aadA基因的下游。它是眾所周知，psbA啟動子和非翻譯的控制下的外源基因區(qū)域被表達(dá)以非常高的水平（丹尼爾等人，1990）。這增強(qiáng)翻譯可能是由于在5'UTR元件（EIBL等人，1999）。載體如先前所述（丹尼爾，1997）并轟擊到煙草葉子，5周后，幾個(gè)主芽出現(xiàn)從每個(gè)轟擊葉片作為獨(dú)立的結(jié)果轉(zhuǎn)化事件。推定的轉(zhuǎn)化的枝條上500微克/毫升確定增長對大觀霉素。外來基因

12、盒引入所述葉綠體基因組的整合通過PCR確認(rèn)篩選主芽。該戰(zhàn)略使用的土地一個(gè)引物在本機(jī)相鄰的結(jié)合點(diǎn)和上的aadA第二引物葉綠體基因組基因。該P(yáng)CR產(chǎn)物不能在核轉(zhuǎn)基因植物或自發(fā)獲得突變體，從而這兩種可能性可以消除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，90%的總枝條得到的是真實(shí)的葉綠體轉(zhuǎn)化。證實(shí)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行一第二輪大觀霉素選擇來實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性。他們植根于大觀霉素的存在下，然后轉(zhuǎn)移到盆中用于進(jìn)一步表征。南方的進(jìn)行印跡分析，以選擇同質(zhì)性T0的線，并確認(rèn)穩(wěn)定維持的在T1代轉(zhuǎn)基因整合（圖1b-d）中。側(cè)翼區(qū)的探針（P1）的確定了未轉(zhuǎn)化的對照植物中7.45千堿基的片段，如預(yù)期的（圖1c）。在葉綠體轉(zhuǎn)基因系中，只有轉(zhuǎn)化的基因組拷貝的觀察所證明由

13、10.5和10.7kb的雜交的pLDAsdHSA和pLDApsbAHSA片段轉(zhuǎn)基因系，分別。要確認(rèn)10.5和10.7kb的片段包含在HSA的基因，同樣的印跡再次探測與HSAP2探頭。正如預(yù)期的，雜交檢測只在葉綠體車t基因系（圖1d）。其他的缺失雜交片段消除同核與葉綠體積分事件轉(zhuǎn)基因株系。文瀾等。第3頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿；可在PMC201210月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿HSA數(shù)量在轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體ELISA法檢測。一個(gè)多植物轉(zhuǎn)化的之間觀察HSA積累360倍的差異兩個(gè)不同的載體（圖3a）:0.02%和7.2%TP在pLDAsdHSA和pLDAps

14、bAHSA轉(zhuǎn)基因系，分別。葉綠體結(jié)構(gòu)與SD序列已證明直接CTB的表達(dá)非常有效（最多茶匙的4%;丹尼爾等人，2001年b）。類似構(gòu)建體，但在質(zhì)體基因組的其它區(qū)域插入，也已經(jīng)成功（3-21%小勺；DeGray等人，2001;哥打等人，1999）,這表明高蛋白質(zhì)表達(dá)水平可以通過使用這個(gè)結(jié)構(gòu)中的操縱子帶的SD來實(shí)現(xiàn)序列。因此，HSA表達(dá)水平低，在pLDAsdHSA轉(zhuǎn)基因植物可以不能因的調(diào)控信號的構(gòu)建體的效果。在的量的差異HSA可能是由于轉(zhuǎn)錄后，翻譯或翻譯后的效果。學(xué)習(xí)在HSA表達(dá)的差異，轉(zhuǎn)錄豐度進(jìn)行了檢查，RNA印跡，這是使用3'psbA基因區(qū)域的探針（圖2）執(zhí)行。該5'psbA/HS

15、Amonocistron成績單遠(yuǎn)遠(yuǎn)比的aadA/SD/HSAdicistron更豐富，但這樣的差異不顯示與HSA360倍的差異線性相關(guān)這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系之間積累。這種缺乏轉(zhuǎn)錄物之間的相關(guān)性豐度和蛋白質(zhì)積累已報(bào)道從幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室當(dāng)psbA基因5'UTR被使用（梅菲爾德等人，1995;的Staub和Maliga,1993,1994年），這意味著一個(gè)在5'UTR的psbA在提高翻譯的重要作用。EIBL等。（1999年）也表明，缺失psbA基因5'UTR的末端序列的降低的能力非編碼區(qū)，以增強(qiáng)翻譯。因此，在轉(zhuǎn)基因pLDApsbAHSA有效翻譯線可能在建立高水平的HSA積累的一個(gè)重要因素

16、。有幾個(gè)研究，表明psbA基因5'UTR賦予光依賴翻譯不僅給體psbA基因（Zerges,2000）,而且還與其他異源蛋白（EIBL等人，1999;的Staub和Maliga,1993,1994年）。HSA下的psbA基因表達(dá)因此5'UTR調(diào)控預(yù)期要輕有關(guān)。變化HSA積累后照明的不同時(shí)期通過ELISA（圖3b）監(jiān)測。HSA數(shù)量被觀察到的最大可達(dá)成熟連續(xù)照明（TP的11.1%）的50小時(shí)連續(xù)葉和2-4倍的下降是8小時(shí)黑暗時(shí)期后觀察。在這樣的差別HSA積累了十分明顯，它是通過檢測凝膠染色用考馬斯亮藍(lán)（圖3c）。的Staub和Maliga（1993年，1994年）和E舊L等。（199

17、9）表明雖然翻譯是在黑暗中被逮捕，該5'psbA/uidA基因mRNA的營業(yè)額非常低。此觀察通過Northern印跡分析，其顯示沒有大的確認(rèn)對HSA亮和暗量5'psbA/HAS轉(zhuǎn)錄之間的差異（圖2,泳道3,4）。因此，在黑暗與光明之間的HSA積累的差異不可能是由于在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性的速率來逮捕的差別，但由于翻譯在黑暗中和HSA的在葉綠體的營業(yè)額。從轉(zhuǎn)化的植物蛋白分離，研究HSA積累的圖案在轉(zhuǎn)基因葉綠體。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)HSA數(shù)量差異其中轉(zhuǎn)基因系（圖3d）。在pLDApsbAHSA轉(zhuǎn)基因品系，人血清白蛋白是部分地溶解與用于總蛋白提取的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。這一觀察建議形成HSA的內(nèi)部聚集在

18、pLDApsbAHSA轉(zhuǎn)基因葉綠體轉(zhuǎn)化。電子顯微鏡和免疫膠體金標(biāo)記，因此是在執(zhí)行轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株進(jìn)一步展開調(diào)查。正如預(yù)期的那樣，電子葉組織的顯微照片中顯示形成大的聚集體或包涵體pLDApsbAHSA轉(zhuǎn)基因葉綠體成熟轉(zhuǎn)化植物（圖4b-d）中。它是有趣地注意到，含有包涵體葉綠體中尺寸增大到HSA容納大量堆積（對比圖4a,D）。然而，表型這些植物的表現(xiàn)正常（圖5）。HSA的pLDAsdHSA轉(zhuǎn)基因量葉綠體是如此之低，這是不能夠檢測上述免疫標(biāo)記背景。在葉綠體大小沒有顯著變化，觀察在這些植物中。文瀾等。第4頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿；可在PMC201210月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者

19、手稿NIH-PA作者手稿包涵體已經(jīng)于原核生物和真核生物的胞質(zhì)溶膠被經(jīng)常觀察當(dāng)異源蛋白的過表達(dá)。在該功能的發(fā)生葉綠體首先報(bào)道了Ketchner等。（1995年）。眾所周知該蛋白質(zhì)聚集成包涵體大多涉及的部分分子間的關(guān)聯(lián)折疊中間體（Mitraki和King,1989）。高蛋白質(zhì)濃度通常會導(dǎo)致條件經(jīng)常超出正常的溶解度極限。即使是最豐富的蛋白質(zhì)光合細(xì)胞，RUBISCO形成了在某些情況下，包涵體。許多自養(yǎng)細(xì)菌和藍(lán)藻的所有包了很多RUBISCOiiJ包容機(jī)構(gòu)積極參與二氧化碳，被稱為竣的固定（夏夫利和英國，1991年）。我們的假設(shè)的基礎(chǔ)上，包涵體形成的過程中，是在對比pLDAs-DHSA?；蚱废?，HSA下p

20、sbA基因5'UTR合成形成大聚集體主要是由于該蛋白質(zhì)的高局部濃度。包涵體形成是策略之一用于減少不穩(wěn)定的蛋白水解重組蛋白（Enfors,1992）。大多數(shù)重組蛋白質(zhì)的研究有被證明是對蛋白水解包涵體內(nèi)高抗。雖然有包涵體內(nèi)免受蛋白酶，有些蛋白水解也可以發(fā)生直接在聚集蛋白（Carrio等人，1999）。HSA也似乎是易感轉(zhuǎn)基因葉綠體中的某些蛋白水解降解。然而，凈余額合成與降解之間是非常有利的，特別是在幾個(gè)小時(shí)連續(xù)照明。正確折疊的HSA可以從包涵體變性完成后痊愈增溶和體外重折疊。從包涵體正確再折疊的HSA是一個(gè)已在數(shù)項(xiàng)研究用大腸桿菌先前已經(jīng)證明常規(guī)程序（拉塔等人（1987）和釀酒酵母（劉天妮等

21、人，1996;o夸克等人，1989年）。在這些情況下，人的和重組的HSA重折疊進(jìn)行比較，這是示這兩種蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上等價(jià)的，這表明HSA可以是從包涵體回收并正確折疊。繼這些準(zhǔn)則協(xié)議，HSA從轉(zhuǎn)基因葉綠體中提取。圖6a顯示染色銀SDS-PAGEO交，其中HSA包涵體可以從可溶級分中分離（泳道3）,其中大部分的細(xì)胞蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。列入溶解后機(jī)構(gòu)和后續(xù)的復(fù)性，HSA可以完全轉(zhuǎn)化為單體形式（圖6a,第5泳道，圖6B,泳道5）。我們的HSA的估計(jì)收益率的結(jié)束協(xié)議是約20%的初始量在葉子，雖然報(bào)告協(xié)議具有在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模被執(zhí)行，并且可以用于工業(yè)進(jìn)一步優(yōu)化制作。據(jù)估計(jì)的HSA在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，以符合成本效益與表達(dá)

22、低至0.1毫克人血清白蛋白/克鮮重的水平（法倫等人，2002）。該回收率溶解包涵體并復(fù)性的HSA后的約0.25毫克HSA應(yīng)鮮重（不含可溶性的HSA在轉(zhuǎn)基因葉綠體），這超過了成本制藥工業(yè)的有效估計(jì)。之一的這項(xiàng)研究的主要目標(biāo)是開發(fā)一種更有效的表達(dá)系統(tǒng)人血清白蛋白，一個(gè)重要的人類的治療性蛋白是高度敏感的降解。HSA的SD的平移控制在成熟的植物表達(dá)序列導(dǎo)致HSA積累的非常低的水平，可能是由于過度的蛋白降解和翻譯不佳率。然而，當(dāng)根據(jù)所表達(dá)的psbA啟動子和5'UTR的控制下，最多在HSA積累500倍增加是在成熟植物觀察到的相比，測試的其它調(diào)節(jié)序列。HSA是觀察到形成大包涵體，結(jié)果即使在的尺寸的顯

23、著增加轉(zhuǎn)基因葉綠體和推測蛋白水解提供保護(hù)，HSA降解。包涵體從其它細(xì)胞蛋白促進(jìn)的HSA純化。HSA的分子具有的化學(xué)和結(jié)構(gòu)功能，而不是酶活性，文瀾等。第5頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿；可在PMC201210月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿因此，復(fù)雜的研究是必要的，以充分展示的功能分子（參見劉天妮等人，1996;大谷等人，1998;Petersen等人，2000;Tarelli等人，1998年；Watanabe等人，2001,b）中。使用體外這樣的功能性研究重折疊的HSA是在進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)步驟葉綠體表達(dá)載體pLDAsdHSA是通過將人血?#白蛋白的1.8kb的Ec

24、oRI構(gòu)造/還不I片段進(jìn)在PLD載體的多克隆位點(diǎn)（丹尼爾等人，1998;丹尼爾等人，2001年b;德科薩等人，2001;鼓達(dá)等人，2000;哥打等人，1999）。這個(gè)片段含有成熟HSA編碼序列之前的Shine-達(dá)爾加諾（GGAGG）,它具有的ATG作為起始密碼子。這些序列進(jìn)行了介紹，通過使用引物：5'-GGAGGCAACCATGGATGCACACAAGAGTGAAGG羽于pLDApsbAHSA載體中，204bp的序列包括啟動子和5'UTRpsbA啟動，通過擴(kuò)增使用煙草DNA為模板PCR下列引物：5'-CCGTCGACGTAGAGAAGTCCGTATT-33'-G

25、CCCATGGTAAAATCTTGGTTTATTTA融合與HSA的基因在做的Ncol位點(diǎn)放置在psbA基因5'UTR的3'端，然后插入到PLD矢量作為一個(gè)生態(tài)RI/沒有我的片段。在繼續(xù)轟擊，載體通過測試Western印跡分析在大腸桿菌中。轟擊和再生無菌煙草（栽培品種佩蒂特哈瓦那）葉使用Bio-Rad公司轟擊的PDS-1000/赫如先前所述生物射彈裝置（丹尼爾，1997）。轟擊葉片進(jìn)行兩輪選擇的含有500微克/毫升的壯觀霉素的RMOP培養(yǎng)基上再生轉(zhuǎn)化體（丹尼爾，1997）。再生后，將植物扎根于500微克/毫升大觀霉素（丹尼爾。等，2001年b）,并轉(zhuǎn)移到在生長室的盆。光照周期為1

26、6小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗。PCR和Southernblot分析PCR方法分析整合不同盒在轉(zhuǎn)化的植物為描述（丹尼爾等人，2001年b角;德科薩等人，2001;哥打等人，1999）。對于Southern印跡分析，總DNA從轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的植物的葉中提?。≦iagen公司的DNeasy試劑盒）?？侱NA（5微克）溶液用BamHI消化，電泳上0.7%瓊脂糖凝膠，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上（DURALON紫外線Stratagene）中。模板用于探測側(cè)翼序列是0.81KB的Bgln/巴姆HI片段和HSA0.75KBNCO我片段。該探針使用寡聚標(biāo)記過程用32P標(biāo)記-的dCTP（蓄勢待發(fā)，Amersham公司）。探針雜交

27、到繼所述膜QUICK-HYB協(xié)議（DURALON紫外線，Stratagene公司）。Northernblot分析總RNA從轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的植物的葉中提?。≧Neasy試劑植物試劑盒，Qiagen公司）。核糖核酸2.5微克進(jìn)行電泳上1.2%瓊脂糖/甲醛凝膠然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上（Stratagene）中。的0.21KB的Xbal/PSTI片段3'的psbA基因用作探針，并使用寡聚標(biāo)記用32P標(biāo)記-的dCTP過程（Amersham）上。HSA定量對ELISA人血白蛋白定量試劑盒（BETHYLLaboratories公司）進(jìn)行。轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化葉（100毫克）的下一個(gè)16小時(shí)生長的盆栽植物文瀾等。第6

28、頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿；可在PMC201210月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿光周期磨碎在液氮中，再懸浮于700微升50毫NaOH和分析根據(jù)制造商的協(xié)議。轉(zhuǎn)基因葉的萃取物稀釋，以適應(yīng)在所提供的人血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)的線性范圍。吸光度在450nm讀數(shù)。該DC蛋白質(zhì)測定法（Bio-Rad公司）來測定總?cè)芙獾牡鞍踪|(zhì)。SDS-PAG醫(yī)口免疫印跡分析轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的葉（100毫克）研磨在液氮中再懸浮于200微升的蛋白質(zhì)提取緩沖液（200mM的Tris-鹽酸pH為8.0,100毫氯化鈉，400mM的蔗糖，14毫3ME,0.05%吐溫20,0.1%SDS中，10毫摩爾E

29、DTA2毫PMSF）。葉的萃取物在煮沸樣品緩沖液（Bio-Rad公司）并電泳在10%聚丙烯酰胺凝膠。分離的蛋白用考馬斯亮藍(lán)G-250或轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜免疫印跡。第一抗體（兔抗HSA,北歐免疫學(xué)），使用以1:10000稀釋，和二次抗體（堿性磷酸酶結(jié)合的抗兔鼠，適馬或羊抗兔HRP共軻，南方生物技術(shù)）在1:15000堿性磷酸酶顏色發(fā)展的試劑，BCIP/NBT在AP顯色緩沖液（Bio-Rad公司），或電致化學(xué)發(fā)光試劑盒（Amersham）被用來進(jìn)行檢測。包涵體溶解可溶性蛋白除去用在0.2MNaCl的，的25mMTris-鹽酸pH值的第一提取7.4,2mM的PMSF和0.1%的TritonX-100。

30、離心60分鐘，在20000個(gè)克后，將沉淀溶解16小時(shí)，在4c在6M的谷鹽酸，0.1M3ME和0.25mM的Tris-鹽酸pH為7.4。離心60分鐘，在20000個(gè)克后，將上清液再慢慢稀釋100倍于100mM氯化鈉，的50mM的Tris-HClpH8.5的和1mMEDTA,在4c下24小時(shí)。微分進(jìn)行電泳在SDS-PAGE10凝膠，銀染色，Bio-Rad公司試劑和協(xié)議。透射電子顯微鏡和免疫膠體金標(biāo)記與未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物幼苗和成熟葉進(jìn)行分析。固定和免疫標(biāo)記的電子顯微鏡所描述的執(zhí)行Vrekleij和Leunissen（1989）。切片第一阻塞，培養(yǎng)1小時(shí)與山羊抗人白蛋白多克隆抗體（北歐免疫學(xué)；稀釋范圍

31、為1:1000至1:10000）,然后溫育2小時(shí)用兔antig-燕麥IgG二抗共軻至10nM金稀釋1：40在封閉溶液。切片檢查中于60千伏蔡司EM10透射電子顯微鏡。致謝這項(xiàng)研究是由美國國立衛(wèi)生研究院從RO1GM63879和Chlorgen公司以高清和“Direccicn補(bǔ)助部分支持一般德INDUSTRIA總統(tǒng)府納瓦拉“（西班牙）和AMC整合的轉(zhuǎn)基因盒到葉綠體基因組和同質(zhì)性的研究。（一個(gè)）地區(qū)同源重組的強(qiáng)調(diào)了本土葉綠體基因組。HSA是通過插入aadA基因的Prrn啟動子上游驅(qū)動所有盒如在所描述的壯觀霉素與另外的啟動子和控制元件的電阻文本。拖曳內(nèi)箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。數(shù)字向右指示當(dāng)用BamHI消化總

32、DNA被探測與所預(yù)測雜交片段探頭P1。（二）0.81千對堿基片段（P1）的側(cè)翼盒和0.75千堿基的片段含有HSA編碼區(qū)（P2）分別用作探針的Southern印跡分析。（光盤）Southernblot分析。1:未轉(zhuǎn)換的DNA;DNA的植物轉(zhuǎn)化的：2,3:文瀾等。第10頁植物生物工程學(xué)家作者的手稿；可在PMC201210月26日。NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿NIH-PA作者手稿pLDAsdHSA;4,5pLDApsbAHSA植物對于第一（T0）和第二（T1）代進(jìn)行了分析。2,4:T0的一代。3,5:T已1代。探測印跡用P1（c）和P2的（四）。AADA：氨基糖昔類3,腺甘酸轉(zhuǎn)移；KB：千堿基；病人：啟動子；Prrn啟動：16SrRNA基因啟動子；SD:閃耀-達(dá)爾加諾。轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)錄模式。與執(zhí)行的Northern印跡分析總RNA提取盆栽植物的葉子。3'的psbA基因的用作探測。1:未轉(zhuǎn)化的植物；2:轉(zhuǎn)化pLDAsdHSA;3轉(zhuǎn)化pLDApsbAHSA后照明或4:在黑暗中。澳化乙錠染色的