瓊膠酶制備工藝

1、瓊膠酶的生產(chǎn)工藝班級：09生工1班 學(xué)號：48 姓名：紀(jì)偉前言 瓊膠是一種從江蘺、石花菜等紅藻中提取出來的水溶性多糖，主要由瓊膠糖和硫瓊膠兩部分組成，瓊膠糖是由1,3 連接的-D-半乳吡喃糖和1,4 連接的3,6-內(nèi)醚-L-半乳吡喃糖殘基反復(fù)交替連接的鏈狀中性糖。硫瓊膠結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和硫酸基，丙酮酸1。瓊膠酶能降解瓊膠多糖，生成瓊膠低聚糖，這些降解產(chǎn)物在食品領(lǐng)域均有良好的應(yīng)用前景。而且，瓊膠酶在PCR 產(chǎn)物回收等方面也極具應(yīng)用價值。近年來隨著糖生物研究及低聚糖制備技術(shù)的不斷發(fā)展，低聚糖的巨大潛力受到越來越多的關(guān)注，及功能性食品、新化工品等研究的熱點。雖

2、然瓊膠低聚糖的研究還遠(yuǎn)落后于肝素等糖類，但韓國、日本已對瓊膠酶及其水解產(chǎn)物的生物活性功能已有一定的研究，證明了一定聚合度的瓊膠低聚糖具有重要的應(yīng)用價值和開發(fā)前景6。由此看來，開展瓊膠酶的研究具有一定的科學(xué)意義和社會效益。在本實驗中介紹從海水中分離到一株高產(chǎn)瓊膠酶-短桿菌（Brevibacterium sp）的海洋革蘭氏陽性菌的植被流程。1 材料與方法1.1 培養(yǎng)基及試劑 2216E 海洋細(xì)菌培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L ）：NaCl 25 ，NH4Cl 10 ，MgSO4.7H2O 5，KCL 10，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.02， CaCl2 0.2，NaH2PO4 0.6，瓊脂 1，pH 7

3、.0；DNS 試劑:見文獻(xiàn)4；0.2M 磷酸緩沖液1.2 取樣及處理方法 用無菌容器取海水，再用無菌海 水稀釋后涂布平板，27恒溫培養(yǎng)。1.3 初篩和復(fù)篩 平板培養(yǎng)48h 后，取出觀察，含瓊膠酶的菌株的菌落周圍會出現(xiàn)明顯的凹陷。選取凹陷明顯的菌株，2216E 海水瓊脂平板劃線分離純化。初篩分離純化得到的菌株，平板培養(yǎng)48h 后用盧戈氏碘液染色觀察。瓊膠平板可以被降解，能夠產(chǎn)生瓊膠酶的細(xì)菌，由于菌落周圍瓊膠被降解,降解后的瓊膠不能著色，因此其菌落周圍會產(chǎn)生水解圈(透明圈)。1.4 菌種保藏 液氮保藏法1.5 粗酶液的制備取純化的菌種接入瓊膠培養(yǎng)基于22搖床培養(yǎng)16h，所得的培養(yǎng)液經(jīng)4、5000r

4、/min離心30min，收集上清液作為粗酶液用于酶活的測定。1.6 酶活測定 在粗酶液中加入磷酸緩沖液（pH 值7.2,體積為所用液體培養(yǎng)基體體積的50），然后取1ml，加入0.8的瓊膠糖溶液1ml，55酶解30min 后于沸水浴中滅活，加入DNS 試劑，在沸水浴中保溫7min 顯色。顯色后的溶液經(jīng)20、2000r/min 離心5min，取上清液稀釋用紫外可見光光度計于540nm 處測OD 值，以煮沸滅活酶液為對照。以每分鐘吸光度增加0.001 為一個酶活（U）。2 酶的分離純化2.1 硫酸銨鹽析發(fā)酵上清液中加入硫酸銨粉末至0% 90% 飽和度，4靜置過夜，6000 r /min 冷凍離心30

5、 min 收集沉淀，用少量冷卻的磷酸鹽緩沖液溶解，置于透析袋中透析除鹽。測定不同區(qū)間透析液的酶活力和蛋白質(zhì)含量，計算酶的比活力，由此確定此瓊膠酶分段鹽析適宜的硫酸銨的飽和度。2.2 DEAE 陰離子交換層析透析后所得酶液上樣于DEAE 陰離子交換柱，用0 0 8 mol /L NaCl 梯度洗脫，流速約為0 5 mL /min，檢測波長為280nm，洗脫液分部收集( 4 5 mL /管) 。測定洗脫管峰部分的試管中溶液的酶活力，將有活性的部分合并。2.3 葡聚糖凝膠G-100 凝膠過濾層析將2.2得到的酶液上樣于20mmol /L( pH7 2)Tris-HCl 平衡的葡聚糖凝膠G-100 凝

6、膠柱并洗脫，控制流速為0 5 mL /min。洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集( 4 5 mL /管) ，分別測定出峰部分試管的酶活力，將有活性的部分合并。3 討論海洋微生物生產(chǎn)瓊膠酶已有報道，1902 年Groleau首次從海水中分離到能分解瓊膠的細(xì)菌瓊膠假單胞菌。從那以后，人們已經(jīng)從海水系統(tǒng)中分離到了多種瓊膠分解菌1，包括Pseudomonas(假單胞菌屬)、Pseudoalteromonsa(假別單胞菌屬)、Streptomyces(鏈霉菌屬)、Alteromonas(別單胞菌屬)、Microscilla、Vibrio(弧菌屬)、Cytophaga(噬細(xì)胞菌屬)等8。它們均是革蘭氏陰性菌，而海

7、洋革蘭氏陽性菌生產(chǎn)該酶的報道似乎仍尚未見。不同的菌產(chǎn)生的瓊膠酶特性不同，而革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌所產(chǎn)的酶在底物專一性、酶解產(chǎn)物等方面可能有更大的差異9。因此，研究革蘭氏陽性細(xì)菌的瓊膠酶的性質(zhì)及底物特異性等，對于獲得不同的活性寡糖成分具有重要意義。本研究從海洋環(huán)境中篩選具有高效產(chǎn)生瓊膠酶能力的革蘭氏陽性菌株，并通過16S rRNA 基因序列的測定，確定該菌為短桿菌（Brevibacterium linens）。并通過產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，將其所產(chǎn)瓊膠酶酶活提高了50多倍。本工作的開展，為進(jìn)一步研究瓊膠酶酶解產(chǎn)物的生理活性、我國海藻資源的高值化利用提供了必要的基礎(chǔ)。3 短桿菌生產(chǎn)發(fā)酵瓊膠酶工藝總流程

8、圖保藏菌種 發(fā)酵液 板框壓瀘 濾液 粗濾 精濾 超濾濃縮 吸附 烘干 磨粉 粉劑成品 液體酶成品 圖 瓊膠酶生產(chǎn)流程圖參考文獻(xiàn)1 王靜雪，江曉路等. 細(xì)菌降解瓊膠的研究進(jìn)展J. 中國水產(chǎn)科學(xué),2001,8(3):9495.2 褚燕，于文功等. 瓊膠酶高產(chǎn)海洋假單胞菌CY24 的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化J.中國海洋藥物， 2003,(5)：14.3 王志，蔡俊鵬，徐麗. 九孔鮑腸道中產(chǎn)酶菌株的篩選及其與深圳灣菌株的比較J.糧食與飼料工 業(yè)，2004, (5):3436.4 張信旭、高海波. 3，5二硝基水楊酸測定古尼蟲草中多糖含量方法J. 貴州化工，2002，27（3）：23385 林加涵，魏文鈴. 現(xiàn)代生物學(xué)實驗M.上冊.6 Jean H. Erasmus, 1997. The role of bacteria in the digestionof seaweed by the ablone HaliotisJ. Aquaculture 155,377-386.7 顧燕松. 紡織生物助劑果膠酶酶活的測定方法J. 紡織科學(xué)研究，2002，3：2935.8 Qhta Y, Nogi Y, et al. Enzymatic Properties and Nucleotideand Amino Ac