生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義

1、現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義 DNA重組技術(shù)與基因檢測(cè)芯片技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù) 發(fā)酵工程及分離提取技術(shù)華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 SCHOOL OF LIFE SCIENCES , EAST CHINA NORMAL UNIVERSITY2007年9月引 言隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物工程的專業(yè)技術(shù)人員的需求更為迫切，特別是生物技術(shù)已經(jīng)滲透到各個(gè)行業(yè)，并已蓬勃發(fā)展。生物技術(shù)的發(fā)展不但要有深厚的理論基礎(chǔ)，而且要求專業(yè)技術(shù)人員具有較強(qiáng)的動(dòng)手能力，因?yàn)樵搶W(xué)科是一門實(shí)踐性較強(qiáng)的科學(xué)。在培養(yǎng)生物技術(shù)專業(yè)學(xué)生時(shí)要特別注意學(xué)生實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ呐囵B(yǎng)，尤其是專業(yè)基本操作。本專業(yè)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)課程已經(jīng)包括生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、微

2、生物實(shí)驗(yàn)、基因工程實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)等課程實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)為培養(yǎng)學(xué)生的基礎(chǔ)操作能力、提高學(xué)生的實(shí)際動(dòng)手能力等奠定了良好的基礎(chǔ)，但是這些實(shí)驗(yàn)都是單個(gè)的小實(shí)驗(yàn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)各自為一體，沒有系統(tǒng)地相互關(guān)聯(lián)，學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)后沒有一個(gè)完整的概念。本實(shí)驗(yàn)以基因工程、細(xì)胞工程和發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，組成了生物工程中上游、中游和下游技術(shù)。其中每一個(gè)部分放棄了原來單獨(dú)小實(shí)驗(yàn)的結(jié)構(gòu)，而改為一個(gè)獨(dú)立的大實(shí)驗(yàn)，增加了學(xué)生的設(shè)計(jì)性和主動(dòng)性。這些實(shí)驗(yàn)既注重和加強(qiáng)了原來各自的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，又注意到相互聯(lián)系。本講義分為三個(gè)部分，第一部分“DNA重組技術(shù)與基因檢測(cè)芯片技術(shù)”；第二部分“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù)”；第三部分

3、“發(fā)酵工程及分離提取技術(shù)”。這些實(shí)驗(yàn)采取大實(shí)驗(yàn)方法，使學(xué)生有一個(gè)完整的操作過程，對(duì)理解生物工程的上游、中游和下游技術(shù)有了感性認(rèn)識(shí)。第一部分DNA重組技術(shù)與基因檢測(cè)芯片技術(shù)黃 靜 陸泉枝 編目 錄前 言31.相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí) .41.1 DNA重組技術(shù)的基本原理.41.2 基因芯片技術(shù)的基本原理.62. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?.72.1 DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?72.2 基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?73. 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 .83.1 實(shí)驗(yàn)材料 .83.2 主要儀器設(shè)備 .83.3 實(shí)驗(yàn)器皿.83.4 細(xì)菌培養(yǎng)基.83.5 分子生物學(xué)試劑.83.6 SDS-PAGE電泳試劑93.7 基因芯片試劑.10

4、4. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容.104.1 DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 .104.2 基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容.115. 習(xí)題.126. 參考資源.126.1參考書目126.2 參考產(chǎn)品目錄.136.3 參考網(wǎng)站.13附錄一 質(zhì)粒DNA的提取14附錄二 瓊脂糖凝膠電泳.15附錄三 DNA的純度、濃度的測(cè)定.17附錄四 DNA的酶切和連接（體外重組）.18附錄五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組DNA分子的轉(zhuǎn)化19附錄六 重組轉(zhuǎn)化子DNA的鑒定（籃白斑篩選法）21附錄七 重組轉(zhuǎn)化子DNA的鑒定（限制性內(nèi)切酶分析法）22附錄八 DNA的體外擴(kuò)增（PCR技術(shù)）23附錄九 SDSPAGE電泳25附錄十 毛囊中DNA的提取28附

5、錄十一基因型檢測(cè)芯片檢測(cè)ACE基因多態(tài)性28前 言二十一世紀(jì)是生物學(xué)的世紀(jì)，分子生物學(xué)作為生物學(xué)最前沿的基礎(chǔ)學(xué)科是生物學(xué)類專業(yè)通向生物高技術(shù)的必修課程。隨著人們?cè)诜肿由飳W(xué)水平上的研究和學(xué)習(xí)的深入和廣泛展開，除了在分子水平上了解生物學(xué)的本質(zhì)特征外，在分子水平如何進(jìn)行生物學(xué)操作是生物學(xué)界共同關(guān)心并十分重視的問題。“DNA重組技術(shù)”就是利用分子生物學(xué)的一般原理闡述在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中所涉及的技術(shù)方法、原理和策略，是一門指導(dǎo)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的理論與實(shí)踐相結(jié)合的課程。隨著生物科學(xué)和生物技術(shù)的日益發(fā)展，人們?cè)絹碓街匾晫?duì)生物學(xué)研究手段的了解和掌握。作為新世紀(jì)的生命科學(xué)學(xué)院的大學(xué)本科生有必要學(xué)習(xí)DNA重組技

6、術(shù)的原理和方法，學(xué)會(huì)和掌握DNA重組技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)講義就是為基因工程操作的入門者而編寫的?；蚬こ碳夹g(shù)的核心內(nèi)容就是DNA重組技術(shù)，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合，然后通過載體把重組的DNA分子引入受體細(xì)胞，使外源DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，按人們的需要生產(chǎn)出不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給后代。根據(jù)這一定義，基因工程技術(shù)涉及到極其廣泛的生物學(xué)新技術(shù)新方法，但它又有一個(gè)基本的操作程序。因而，我們按照DNA重組技術(shù)的操作程序來安排實(shí)驗(yàn)，即從載體的選擇目的基因的制備體外DNA的重組（酶切與連接）重組DNA分子引入受體細(xì)胞

7、轉(zhuǎn)化子的篩選重組DNA分子的鑒定等步驟編排成一個(gè)綜合性大實(shí)驗(yàn)。在這個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)中，每一步實(shí)驗(yàn)既相對(duì)獨(dú)立又與下一步實(shí)驗(yàn)緊密相連，只有獲得第一個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能開始第二個(gè)實(shí)驗(yàn)。因此，實(shí)驗(yàn)也涵蓋了所要訓(xùn)練的單項(xiàng)技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)取材方面，我們以大腸桿菌為基本資料，建立適合于大腸桿菌的DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)。我們旨在通過這些實(shí)驗(yàn)，讓同學(xué)們獲得分子生物學(xué)最基本的技術(shù)訓(xùn)練，掌握最基本、最常用的技術(shù)，并對(duì)DNA重組技術(shù)有一個(gè)比較全面而系統(tǒng)的概念。此外，生物芯片技術(shù)已被國際公認(rèn)為是正在和將要給二十一世紀(jì)的生物科學(xué)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域帶來革命性變化的新技術(shù)，作為新世紀(jì)生物技術(shù)專業(yè)的大學(xué)生，有必要接觸生物芯片的一些基

8、本知識(shí)。鑒于目前實(shí)驗(yàn)條件有限，本實(shí)驗(yàn)教程的內(nèi)容僅涉及一種基因（ACE基因）的多態(tài)性檢測(cè)，讓同學(xué)們了解基因檢測(cè)芯片技術(shù)的一般原理和操作技術(shù)，為今后的工作和學(xué)習(xí)打下基礎(chǔ)。作 者2006.91. 相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)1.1 DNA重組技術(shù)的基本原理基因工程技術(shù)的核心內(nèi)容就是DNA重組技術(shù)，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合，然后通過載體把重組的DNA分子引入受體細(xì)胞，使外源DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，按人們的需要生產(chǎn)出不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給后代。強(qiáng)調(diào)外源核酸分子（一般情況下都是 DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然種的界限

9、，將來自不相關(guān)物種的基因放入一個(gè)宿主中是DNA重組技術(shù)的重要特征。另一個(gè)特征是繁殖。重組DNA技術(shù)主要包括以下幾個(gè)要素：載體；工具酶；外源DNA，即要克隆或表達(dá)的DNA片斷；原核或真核宿主細(xì)胞?；蚩寺〉幕静襟E是先用限制性內(nèi)切酶切割外源 DNA 和載體（質(zhì)粒 DNA 載體或噬菌體載體），然后連接酶連接，組成DNA重組分子（重組質(zhì)粒，見圖1），轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞，構(gòu)建出基因文庫，再篩選。除了通常的克隆外，還有亞克隆。初步克隆中的外源片段往往較長，含有許多目的基因片段以外的 DNA 片段，在諸如表達(dá)、序列分析和突變等操作中不便進(jìn)行，因此必須將目的基因所對(duì)應(yīng)的一小段 DNA 找出來，這個(gè)過程叫“亞克隆

10、”。圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖載體的作用是把外源DNA帶進(jìn)宿主細(xì)胞，并使之在細(xì)胞內(nèi)建立穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)繁殖、傳代或進(jìn)行表達(dá)。質(zhì)粒載體是最常見的載體，也是使用最方便的載體。它應(yīng)用了質(zhì)粒的復(fù)制、拷貝數(shù)及不相容性等性質(zhì)。質(zhì)粒載體有抗性基因、琥珀突變抑制基因等多種選擇標(biāo)記和 -互補(bǔ)、插入失活等篩選標(biāo)記。常見的質(zhì)粒載體有： pBR322、 pUC18/19、 pUC118/119、 pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的質(zhì)粒載體，如： pBluescriptKS（）。大腸桿菌表達(dá)載體是最常見的原核表達(dá)載體，可分為表達(dá)融合蛋白的載體和非融合蛋白表達(dá)載體。常用的標(biāo)簽蛋白有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、六聚組氨酸肽、蛋

11、白質(zhì) A 和纖維素結(jié)合位點(diǎn)等。重組DNA所涉及的工具酶，最主要的是II型限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶。 型限制性內(nèi)切酶用來切割DNA，相當(dāng)于基因工程中的“剪刀”。II型限制性內(nèi)切酶識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割 DNA ，產(chǎn)生帶 3- 羥基和 5- 磷酸基團(tuán)的 DNA 產(chǎn)物，需 Mg2+ 的存在才能發(fā)揮活性。識(shí)別序列主要為 4bp6bp ，或更長且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異。如EcoRI 和 Hind 的識(shí)別序列和切割位置如下。 EcoR GAATTC Hind AAGCTT CTTAAG TTCGAA連接酶則是將兩段核酸連接起來的酶，

12、相當(dāng)于基因工程中的“糨糊”。常用的T4DNA連接酶是在T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)和分離的，需 Mg2+ 和ATP的存在才能發(fā)揮活性。它能催化兩條匹配DNA鏈的3OH和5P之間形成磷酸二酯鍵而把兩個(gè)DNA分子連接在一起。外源DNA就是需要克隆的DNA片斷，一般有四種來源。（1）限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的片斷，經(jīng)電泳分離后回收獲得；（2）大DNA分子經(jīng)人工剪切產(chǎn)生的片斷，這種片斷一般是平末端；（3）cDNA，即與mRNA互補(bǔ)的DNA，由真核基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄制備；（4）人工合成的基因，例如根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序和遺傳密碼合成的一些基因。外源DNA分子與載體（質(zhì)粒）經(jīng)過相同的酶切可以產(chǎn)生相互

13、匹配的粘末端或平末端，經(jīng)DNA連接酶連接就構(gòu)成了重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化就是指將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌（受體細(xì)胞）的過程。這一步是實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖。受體細(xì)胞要接納外源DNA，必須處于感受態(tài)。所謂感受態(tài)，就是細(xì)菌具有吸收周圍環(huán)境中的DNA的生理狀態(tài)。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和CaCl2法將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和CaCl2感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔，因而使外源DNA能進(jìn)入細(xì)胞，一般轉(zhuǎn)化率為 1

14、09 1010 轉(zhuǎn)化子 /g DNA；對(duì)于熱激法，是利用冰冷的 CaCl2處理對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的 “感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化率約106 107轉(zhuǎn)化子 /g DNA。獲得轉(zhuǎn)化子后可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。首先可根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征進(jìn)行初步篩選。由于載體都具有供篩選用的遺傳標(biāo)記，如抗生素，細(xì)胞轉(zhuǎn)化后獲得了這種遺傳特性，使用含適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)抗生素的培養(yǎng)基即可初步篩選出轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。經(jīng)過培養(yǎng)初步篩選出來的細(xì)菌不一定都含有重組DNA，還需進(jìn)一步對(duì)DNA進(jìn)行分析。常用方法之一是進(jìn)行重組質(zhì)粒的抽提，然后電泳分析，觀察其分子量與原有載體相比是否增大；方法之二是將抽提的重組質(zhì)粒進(jìn)

15、行限制性內(nèi)切酶分析，觀察酶切下來得到的DNA片段大小是否與預(yù)計(jì)的相符；方法之三是以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，觀察PCR產(chǎn)物的大小是否與目的基因大小相符；方法之四則是將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，直接分析重組質(zhì)粒上的插入片段即目的基因的大小與序列是否正確。在確證得到核酸序列一致的基因后，接下來就要想辦法使該基因得到表達(dá)，獲得基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白（肽）。通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量化、比較及特性鑒定。SDS-PAGE電泳不但能觀察到蛋白在電場(chǎng)中的泳動(dòng)位置，而且還能知道蛋白的分子量大小以及由幾個(gè)亞基組成。此外，還可將電泳膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以親和反

16、應(yīng)或免疫反應(yīng)來檢測(cè)特異蛋白的存在，即所謂的Western Blotting。在基因表達(dá)產(chǎn)物也得到確證之后，就可以對(duì)表達(dá)的蛋白（肽）進(jìn)行發(fā)酵和分離純化，并研究其生物學(xué)功能。1.2基因芯片技術(shù)的基本原理基因芯片（genechip）技術(shù)是自20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新興技術(shù)，又稱DNA芯片（DNA chip），是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)或CCD成像掃描系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。基因芯片基本技術(shù)通常包

17、括：芯片制作、樣品制備（標(biāo)記）、生物分子反應(yīng)（雜交）以及數(shù)據(jù)分析（雜交信號(hào)的檢測(cè)及分析）等步驟。在本實(shí)驗(yàn)教程中，我們給大家介紹單基因多人份的基因檢測(cè)芯片的基本原理和技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)教程使用的基因芯片制作是在醛基修飾后的玻璃基片上制造的。DNA探針（寡核苷酸片段，與被檢測(cè)的靶DNA互補(bǔ)）溶液與點(diǎn)樣緩沖液以1：1比例混合，通過點(diǎn)樣儀點(diǎn)到醛基基片上，然后用芯片活化液固定8小時(shí)。固定后DNA探針將與醛基玻片共價(jià)結(jié)合，形成陣列；在基因陣列周圍貼上反應(yīng)艙，完成芯片制作過程。樣品制備：通過向樣本，如毛發(fā)、口腔粘膜脫落細(xì)胞、全血中加入抽提液，煮沸、離心等操作，使樣品中的細(xì)胞裂解釋放出DNA、同時(shí)使蛋白變性沉淀，完

18、成樣本DNA的抽提。抽提獲得的染色體DNA濃度太小，直接進(jìn)行雜交檢測(cè)無法獲得信號(hào)。將抽提獲得的染色體DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對(duì)待檢基因序列的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)20bp左右的上、下游引物用于擴(kuò)增靶DNA，同時(shí)，在引物的5端加上標(biāo)簽序列，對(duì)擴(kuò)增靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。雜交反應(yīng)：將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物變性成單鏈DNA分子，由于基因芯片上固定有與標(biāo)簽序列相結(jié)合的標(biāo)簽探針，可與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過堿基配對(duì)進(jìn)行特異性雜交。這樣，芯片上的每個(gè)標(biāo)簽探針都結(jié)合有一個(gè)擴(kuò)增靶DNA分子。然后將芯片與經(jīng)生物素（Biotin）標(biāo)記的特異性檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，就可以知道樣本DNA序列中的SNP信息，即到底是屬于野生型還是突變

19、型，是雜合子還是純合子。在雜交反應(yīng)中，序列組成、靶標(biāo)DNA分子和探針的長度、雜交溫度、鹽濃度等均會(huì)影響雜交效率和強(qiáng)度。顯色原理：采用生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶（AP）催化的NBT/BCIP顯色反應(yīng)的檢測(cè)方法。首先，特異性檢測(cè)探針上的生物素先與鏈親和素堿性磷酸酶復(fù)合物（Stripavitin-AP）反應(yīng)，生成新的復(fù)合物：Biotin-Stripavitin-AP，后者發(fā)生如下的顯色反應(yīng)：Biotin-Stripavitin-AP + BCI-P BCI-OH + Pi （pH 7.5）BCI-OH + NBT 藍(lán)紫色沉淀 其中，BCIP為5溴-4氯-3吲哚磷酸；NBT為硝基四氮唑藍(lán)。檢測(cè)原理：采用C

20、CD（ Charge Coupled Device 即電荷耦合器件）原理，將芯片上的色斑信號(hào)掃描成圖像，用Array Doctor分析軟件進(jìn)行分析，給出靶基因SNP信息。單基因多人份基因芯片檢測(cè)原理示意圖2實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?.1 DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟊緦?shí)驗(yàn)利用質(zhì)粒載體克隆外源DNA片段，通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)大家可以掌握質(zhì)粒載體的抽提、外源DNA的準(zhǔn)備、酶切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及陽性克隆子的鑒定和驗(yàn)證等。2.1.1 提取基因工程中的運(yùn)載基因的載體DNA，掌握最常用的提取和純化DNA的方法。2.1.2 掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。并以此法進(jìn)一步區(qū)分質(zhì)粒D

21、NA中染色體DNA和RNA的污染；估計(jì)出質(zhì)粒DNA分子量的大小；觀察質(zhì)粒DNA三種基本構(gòu)象的比例；也可用此法純化DNA及計(jì)算出DNA的濃度，是基因工程實(shí)驗(yàn)中最常用的實(shí)驗(yàn)方法。2.1.3 學(xué)習(xí)和掌握用紫外分光光度法測(cè)定DNA的純度和濃度。2.1.4 學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法。了解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定DNA片段的有效方法。2.1.5 學(xué)習(xí)和掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備過程。2.1.6 掌握質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法，學(xué)習(xí)把體外重組的DNA（即連接反應(yīng)物）導(dǎo)入受體細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)胞），使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選擇出陽性轉(zhuǎn)化子。2.1.

22、7 學(xué)習(xí)從轉(zhuǎn)化子中篩選和鑒定目的克隆的方法，掌握菌落PCR和限制性內(nèi)切酶酶切兩種鑒定方法。2.1.8 掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)，了解引物設(shè)計(jì)的一般要求。2.2基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?.2.1 了解從毛囊中提取基因組DNA的原理和技術(shù)。2.2.2 了解在PCR擴(kuò)增過程中如何對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記。2.2.3 掌握核酸雜交反應(yīng)原理，將樣品與生物素標(biāo)記的探針雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)得出基因的基因型。2.2.4 熟悉利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)人染色體基因多態(tài)性的基本原理和方法。3實(shí)驗(yàn)材料和儀器3.1實(shí)驗(yàn)材料：菌種：大腸桿菌JM101，大腸桿菌DH5質(zhì)粒：pUC18/19（Ampr）3.2主要儀器設(shè)備：超

23、凈工作臺(tái)；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫振蕩器；恒溫水浴鍋；微波爐；低溫冰箱；臺(tái)式高速離心機(jī)；漩渦混合器；分析天平；脫色搖床穩(wěn)壓電泳儀；垂直/水平式電泳槽；紫外可見光分光光度計(jì)；紫外檢測(cè)儀；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)PCR擴(kuò)增儀；凝膠成像分析系統(tǒng)ACE基因檢測(cè)芯片（上海百傲科技有限公司提供）BaiO生物芯片識(shí)讀儀（上海百傲科技有限公司提供）Array Doctor分析軟件（上海百傲科技有限公司提供）3.3實(shí)驗(yàn)器皿：錐形瓶；試管；燒杯；量筒；三角推棒；培養(yǎng)皿；tip頭；Eppendorf管；微量移液槍（2l1000l）；微量進(jìn)樣器（50l或100l）；一次性手套，牙簽。3.4細(xì)菌培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基蛋白胨 1

24、.0酵母膏 0.5NaCl 0.5%pH 7.5固體培養(yǎng)基加入2瓊脂。將上述培養(yǎng)基滅菌后（1.1公斤/ cm2，保溫20分鐘），加入100mg/ mL的Amp，使其終濃度為100ug/ mL。3.5分子生物學(xué)試劑：RNaseA溶液: 10mg/ mL，0.1M NaOAc pH 4.8, 0.3mM EDTA，80100加熱10分鐘，自然冷卻到室溫，分裝，20保藏。DNA Marker；限制性內(nèi)切酶EcoRI或Hind III；DNA（線狀）；質(zhì)粒純化Kit；TaqDNA聚合酶，4dNTP；引物溶液I：50mM 葡萄糖；25mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA溶液II：0.

25、2N NaOH；1%(w/v)SDS溶液III：5M KAc 60mL； 冰醋酸 11.5 mL； H2O 28.5 mL核酸上樣緩沖液：50蔗糖，0.2溴酚蘭溶液（1） TBE 緩沖液（Tris-硼酸）：89 mM Tris-硼酸；2 mM EDTA（pH8.0）。（2） TAE緩沖液（Tris-HAc）：0.04M Tris-HAc，1 mM EDTA（pH8.0）。瓊脂糖：按所需濃度稱取，并用核酸電泳緩沖液配制，微波爐或煤氣加熱熔化使用。EB染液替代品：Goldernview 染料氨芐青霉素（Amp）溶液: 100mg/mL，無菌水溶解IPTG溶液（20，m/V）：20mg X-gal

26、溶于 1mL二甲基甲酰胺中，-20 避光保存X-gal溶液（20，m/V）：1g IPTG 溶于 4mL去離子雙蒸水中，定容至 5mL，過濾滅菌后，-20 保存 苯酚：氯仿：異戊醇25：24：1（V/ V/ V）70%冷乙醇（20保藏）3.6 SDS-PAGE電泳試劑：儲(chǔ)備液12M Tris-HCl (pH8.8),100ml21M Tris-HCl (pH6.8),100ml310%SDS,100ml450%甘油,100ml550%溴酚蘭,10ml工作液A液：100ml130%丙烯酰胺(29.2g)20.8%甲叉雙丙烯酰胺(0.8%)加蒸餾水至100ml，過濾，棕色瓶避光保存。B液：100m

27、l175ml 2M Tris-HCl(pH8.8)24ml 10%SDS1 21ml H2OC液：100ml150ml 1M Tris-HCl(pH6.8)24ml 10%SDS346ml H2O過硫酸銨，5ml0.5g過硫酸銨溶于5ml 蒸餾水。電泳緩沖液，1L13g214.4g甘氨酸31g SDS加蒸餾水定容到1L。5上樣緩沖液，10ml10.6ml 1M Tris-HCl (pH6.8)25ml 50% 甘氨酸32ml 10% SDS40.5ml 2-巰基乙醇51ml 1% 溴酚蘭染色液, 1L11g考馬斯亮藍(lán)R-2502450ml甲醇3450ml H2O4100ml乙酸脫色液，1L11

28、00ml乙醇2100ml冰醋酸3800ml H2O其它試劑均為國產(chǎn)分析純3.7基因芯片試劑：毛囊DNA提取試劑盒，Baio基因型檢測(cè)芯片試劑盒（上海百傲科技有限公司提供）4實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4.1 DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4.1.1載體的制備從大腸桿菌中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載外源基因的載體。并將提取到的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察質(zhì)粒大小、構(gòu)型和純度。為作下一步的酶切，連接及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，還必須測(cè)定DNA的純度和濃度。將提取到的質(zhì)粒用分光光度計(jì)檢測(cè) 260nm、280nm 波長吸光值，可檢測(cè)質(zhì)粒純度并根據(jù)吸光值計(jì)算出濃度。4.1.2目的基因的制備根據(jù)已知基因序列，設(shè)計(jì)兩條引物，運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增出目的基因片斷。將擴(kuò)

29、增片斷用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用PCR產(chǎn)物回收Kit純化PCR產(chǎn)物，為下一步酶切準(zhǔn)備。注意，如果是真核基因，應(yīng)該是用其cDNA序列進(jìn)行克隆。4.1.3體外DNA的重組（酶切與連接）選擇合適的兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)供體（目的基因）和受體（載體）同時(shí)進(jìn)行酶切，產(chǎn)生相匹配的粘性末端，再利用T4DNA連接酶將基因片段與載體連接起來，在體外構(gòu)建成重組DNA分子。4.1.4重組DNA分子引入受體細(xì)胞制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將重組DNA分子轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，抗性平板篩選并培養(yǎng)過夜觀察。4.1.5轉(zhuǎn)化子的篩選利用重組質(zhì)粒的氨芐抗性和藍(lán)白斑篩選法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩。4.1.6重組DNA分子的鑒定采用菌落PCR法鑒定和限

30、制性內(nèi)切酶分析來進(jìn)一步確定陽性克隆?；蛘咄ㄟ^DNA測(cè)序來直接檢驗(yàn)。4.1.7目的基因產(chǎn)物的檢測(cè)將陽性克隆發(fā)酵培養(yǎng)，若是誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒，則加入誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后用SDS-PAGE分析目的基因產(chǎn)物的大小與表達(dá)量等，若有合適抗體，還可直接用Western blotting檢測(cè)目的基因是否表達(dá)。4.2 基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4.2.1毛囊中DNA的抽提采集帶毛囊的毛發(fā)，經(jīng)裂解后分離出全基因組DNA。4.2.2人染色體ACE基因的PCR擴(kuò)增將抽提獲得的全基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對(duì)ACE基因（Angiotensin Converting Enzyme 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）序列的SNP位點(diǎn)，

31、設(shè)計(jì)20bp左右的上、下游引物用于擴(kuò)增靶DNA，同時(shí)，在引物的5端加上標(biāo)簽序列，對(duì)擴(kuò)增靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。4.2.3 ACE基因的基因型檢測(cè)芯片雜交、顯色、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)雜交，使PCR產(chǎn)物的標(biāo)簽序列與基因芯片上的標(biāo)簽探針結(jié)合。提高溫度，將基因芯片與帶有生物素標(biāo)記的特異性檢測(cè)探針雜交、顯色并進(jìn)行檢測(cè)分析。4.2.4檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（瓊脂糖凝膠電泳方法）人類ACE基因的16內(nèi)含子中，存在287bp的插入/缺失(I/D)多態(tài)性。因此通過PCR擴(kuò)增再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)有490bp(I等位基因)和190bp(D等位基因)兩個(gè)片段，故可出現(xiàn)三種DNA基因型：（1）由兩個(gè)490

32、bp等位基因構(gòu)成的基因型II；（2）由兩個(gè)190bp等位基因構(gòu)成的基因型DD；（3）由一個(gè)490bp、一個(gè)190bp等位基因組成的基因型ID。因此，可以通過電泳驗(yàn)證基因芯片的檢測(cè)結(jié)果。13圖4.1 ACE擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果M：分子量標(biāo)記II：純合子插入型ID：雜合子插入/缺失型DD：純合子缺失型5習(xí)題1.原核表達(dá)系統(tǒng)的基本要素有哪些？2.為何真核基因在原核系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)要用其cDNA進(jìn)行克??？3.實(shí)驗(yàn)小論文以“基因的克隆和表達(dá)”為題，模擬一個(gè)來源于真核生物的基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)的實(shí)驗(yàn)論文。要求簡單介紹欲克隆基因的背景知識(shí)，克隆策略及重組DNA分子篩選等內(nèi)容。書寫格式請(qǐng)參考中國科學(xué)雜志上相關(guān)文

33、章格式。實(shí)驗(yàn)小論文中應(yīng)包含如下內(nèi)容：標(biāo)題，摘要（中英文），關(guān)鍵詞，前言，材料，方法，結(jié)果，討論和參考文獻(xiàn)等。4.如何實(shí)現(xiàn)一人份多基因檢測(cè)的基因芯片設(shè)計(jì)、制備？6參考資源6.1參考書目：1. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版），科學(xué)出版社翻譯版，20022. 基因工程原理（第二版）上冊(cè)，吳乃虎，科學(xué)出版社，19983. 基因工程原理（第二版）下冊(cè)，吳乃虎，科學(xué)出版社，20014. 現(xiàn)代基因操作技術(shù)，胡福泉主編，人民軍醫(yī)出版社，20005. 基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社，19996. 基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)（第二版），彭秀玲編著，湖南科學(xué)技術(shù)出版社，19987. 生物芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)教程，邢婉麗，程

34、京主編，清華大學(xué)出版社，20066.2參考產(chǎn)品目錄：很多分子克隆技術(shù)是由一些知名公司開發(fā)出來的，其分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄產(chǎn)品介紹部分有很多值得我們學(xué)習(xí)的信息。她既對(duì)產(chǎn)品所涉及的基因操作原理作出論述，也對(duì)產(chǎn)品的技術(shù)參數(shù)作出詳細(xì)的比較介紹。其工作原理、操作步驟深入淺出，圖文并茂，幫助初學(xué)者對(duì)操作原理和實(shí)驗(yàn)步驟的理解。其附件、附表等參考信息欄目對(duì)研究工作者也有很強(qiáng)的借鑒意義。如 New England Biolabs 公司在分子生物學(xué)試劑方面， Bio-Rad公司在分子生物學(xué)儀器方面 都有很深的造詣。1.Invitrogen公司分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄2.New England Biolabs 公司分子生物學(xué)

35、產(chǎn)品目錄 3.Promage公司分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄 4.TAKARA公司分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄 6.3參考網(wǎng)站：互聯(lián)網(wǎng)上有很多關(guān)于分子生物學(xué)以及生物芯片的網(wǎng)站，這里僅僅羅列了一部分。 生物谷 中國生物論壇 中文分子生物學(xué)個(gè)人交流網(wǎng) 冷泉港實(shí)驗(yàn)室 美國國立生物信息中心上海百傲科技有限公司附錄.附錄一 質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。

36、本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。一、原理：從細(xì)菌如大腸桿菌或枯草桿菌中提取DNA的方法很多，其分離原理可根據(jù)DNA分子大小的不同、堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來進(jìn)行。目前常用的有堿變性提取法、酸酚法；PEG法、煮沸法以及溴化乙錠氯化銫梯度離心法。這些方法各有利弊，有的操作繁瑣，難以控制，有的純度不夠，有的需要昂貴的儀器。而堿變性法被認(rèn)為是一種既經(jīng)濟(jì)，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用這種方法提取的DNA可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化。堿變性法提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，

37、染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不能完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAC緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，保存于溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而去除，從而達(dá)到分離的目的。二、操作步驟：1. 挑取大腸桿菌JM101（pUC19）單菌落接種于20mLLB液體培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素100ug/ mL），于37振蕩搖床中培養(yǎng)過夜（1012小時(shí)）。2. 取1.2mL培養(yǎng)物入一1.5mL Eppendorf管中，12000

38、 rpm，離心20s，棄盡上清。3. 往沉淀中加100ul溶液I，旋渦器上振蕩使菌體重懸，37水浴15min。4. 往3中溶液加200ul溶液II，輕柔混勻至溶液澄清，冰浴5min。5. 往4中溶液加150ul溶液III，輕柔顛倒2次，冰浴10min；12000rpm，離心15min。吸上清，轉(zhuǎn)入一新的1.5mL Eppendorf管中。6. 往5中上清加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）混合物，用力混勻成乳狀不分層；12000rpm，離心10min。7. 吸6中上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5mL Eppendorf管中，加入等體積氯仿，用力混勻；12000rpm，離心5min。8. 吸7中

39、上清至新的無菌1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，室溫放置15分鐘；或加入兩倍體積的無水乙醇；-20 靜置30min。12000rpm，離心15min。9. 小心棄去上清，加入1mL -20預(yù)冷的70%乙醇，顛倒3次，12000rpm，離心2min；棄盡液體，室溫干燥至沉淀變透明。10. 加入20ul無菌水溶解沉淀；RNaseA（10mg/mL） 1ul（1/20體積加入，終濃度0.5 mg/mL），37水浴15分鐘。-20保藏。pUC19質(zhì)粒示意圖附錄二 瓊脂糖凝膠電泳一、原理： 溴化乙錠（EB）在紫外光照射下能發(fā)出熒光。當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，加入的EB就插入DNA分子中形成熒

40、光絡(luò)合物，使發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍。而熒光的強(qiáng)度正比于DNA含量，如將已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品做電泳對(duì)照，就可估計(jì)出待測(cè)樣品的濃度。電泳后的瓊脂糖凝膠直接在紫外燈下拍照，只需510ng（1ng=10-9g）DNA，就可從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測(cè)0.05g0.01g的DNA。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值呈反比關(guān)系。可以以此特征區(qū)別染色體DNA、質(zhì)粒DNA和RNA，若用小刀取下含質(zhì)粒DNA的凝膠帶經(jīng)電泳洗脫則可得純DNA。若將質(zhì)粒DNA用單一切點(diǎn)的酶消化后，與已知分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對(duì)照，觀察其遷移距離就可估計(jì)出該樣品分子量的大小。DNA分子在凝膠中泳動(dòng)的速度還與

41、DNA分子本身的構(gòu)型有關(guān)，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）,一條鏈斷開的開環(huán)DNA（ocDNA）,兩條都斷開的線狀DNA（LDNA）在電泳中的遷移速率不同，一般cccDNA泳動(dòng)最快，LDNA次之，ocDNA最慢，因而可以通過電泳來區(qū)別質(zhì)粒DNA的構(gòu)型。二、操作步驟： 1、選擇適當(dāng)大小的電泳槽（大、中、小、微等類型）。 2、選擇適當(dāng)大小的點(diǎn)樣梳其底部離電泳槽水平面的距離為12mm。 3、制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子量的大小，決定凝膠中瓊脂糖的含量。一般可參照下表：瓊脂濃度（%）2.0分離線型DNA分子的有效范圍（Kb）5601200.8100.570

42、.460.240.13 4、稱取1%濃度的瓊脂糖，加入TBE（或TAE）緩沖液，在微波爐中熔解，待凝膠冷卻到50左右時(shí)，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。 5、待凝膠冷卻至凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，使其正好漫過凝膠表面，然后取出點(diǎn)樣梳，保持點(diǎn)樣孔的完好。 6、在待測(cè)樣品中加入1/5體積的上樣緩沖液，混勻后小心地進(jìn)行點(diǎn)樣。每孔加樣1015l,一般不超過20l。 7、打開電源開關(guān)，最高電壓不超過5V/cm,即小電泳槽不得超過50V,當(dāng)瓊脂糖濃度低于0.5%時(shí)，電泳溫度不能太高。 8、電泳時(shí)間隨實(shí)驗(yàn)具體要求而定，一般待DNA帶分開后即可停止，當(dāng)溴酚藍(lán)泳動(dòng)至2/3凝膠時(shí)可停止電泳，約需1.5小

43、時(shí)左右。 9、電泳結(jié)束后，小心取出凝膠，放入染色液中染色15左右。 10、將凝膠放在紫外觀察燈下觀察電泳結(jié)果。質(zhì)粒構(gòu)型觀察示意圖附錄三 DNA的純度、濃度的測(cè)定紫外分光光度法一、原理：核酸具有吸收紫外光線的能力，在波長為260nm的條件下具吸收峰值，而蛋白質(zhì)在280nm時(shí)具有吸收峰值。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，純核酸溶液OD260=1.82.0時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到所要求的純度。在樣品中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)時(shí)，會(huì)使OD260/OD280的比值下降。用此法測(cè)定時(shí)，只能區(qū)別核酸和蛋白質(zhì)，而無法區(qū)別質(zhì)粒DNA與染色體DNA及RNA。二、計(jì)算DNA濃度（g/mL）=OD260稀釋倍數(shù)/0.026LDNA純度= OD260/

44、OD280（要求比值在1.82.0范圍內(nèi)）注：L為比色杯厚度（cm,一般為1cm。）核酸和蛋白質(zhì)的吸光度蛋白質(zhì)/%核酸/%OD260：OD280蛋白質(zhì)/%核酸/%OD260：OD28010000.5745551.899551.0640601.9190101.3235651.9385151.4830701.9480201.5925751.9575251.6720801.9770301.7315851.9865351.7810901.9860401.815951.9955451.8401002.0050501.87三、操作步驟：1、取石英杯兩只，分別加入TE緩沖液2990l。2、在對(duì)照杯中加入10

45、l TE buffer,在樣品杯加入10l樣品。蓋上蓋子，上下幾次搖勻。3、放入751型分光光度計(jì)的比色槽中，使用氫燈，分別測(cè)出OD260和OD280的值。4、按上述計(jì)算公式算出你所制備的DNA的純度和濃度。附錄四 DNA的酶切和連接（體外重組）一、原理：各種限制性內(nèi)切酶能專一的識(shí)別和切開特定的堿基順序：Hind III酶識(shí)別和切割順序?yàn)椋?AAGCTT33TTCGAA5Hind III在載體pUC19上只有一個(gè)酶切點(diǎn)，用Hind III酶切載體pUC19時(shí)，就產(chǎn)生帶有AGCTT的5粘性末端的線型DNA分子。用Hind III切DNA（48.5kb），則產(chǎn)生23130，9416，6557，43

46、61，2322，2027，564，125bp大小8個(gè)片段。由于采用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pUC19和DNA，在T4DNA連接酶的作用下，pUC19（載體）和DNA（供體）不同大小片段的DNA粘性末端共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)線型的重組DNA分子。在T4DNA連接酶的繼續(xù)作用下，重組DNA分子兩端的粘性末端又共價(jià)結(jié)合，自身環(huán)化成為一個(gè)重組的環(huán)形DNA分子。二、操作步驟：1、酶切反應(yīng)：按順序在滅菌的1.5mLEppendorf管中加入（1） 無菌去離子水（2） 10酶切緩沖液（3） DNA或質(zhì)粒pUC19（4） 限制性內(nèi)切酶EcoRI或Hind III（在冰浴中進(jìn)行，防止酶失活）。蓋緊上述兩只Eppe

47、ndorf管蓋子，用手指彈幾次使混合均勻。在離心機(jī)上離心5s，使樣品溶液集中到Eppendorf管底部。于37水浴酶解2小時(shí)后，取上述兩個(gè)樣品的酶切反應(yīng)物溶液各4l，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切反應(yīng)情況。剩余的樣品繼續(xù)在37水浴中酶切2小時(shí)。待電泳觀察酶切反應(yīng)完全后，將上述反應(yīng)液置65水浴中保溫10-15分鐘，中止酶切反應(yīng)。2、連接反應(yīng)：按順序在滅菌的1.5mLEppendorf管中加入（1） 無菌去離子水（2） 10T4DNA連接酶緩沖液（3） 供體：DNA酶切（純化）產(chǎn)物（4） 載體：質(zhì)粒pUC19酶切（純化）大片段（5） T4DNA連接酶（在冰浴中進(jìn)行，防止酶失活）注意：為取得較好的轉(zhuǎn)化

48、效率，供體和載體的摩爾比應(yīng)控制在310：1。 將連接反應(yīng)管中搖勻后放入12條件下連接反應(yīng)過夜或16下連接反應(yīng)2-3小時(shí)。操作中的注意事項(xiàng)：1、基因工程是微量操作技術(shù)，DNA樣品與內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的標(biāo)準(zhǔn)性。2、要注意酶切時(shí)加樣的次序，各項(xiàng)試劑加好后，最后再加酶液。待用的內(nèi)切酶要放在冰中，用后立即放回-20冰箱，防止內(nèi)切酶失活。3、凡用在酶切和連接反應(yīng)中的一切塑料器皿（Eppendorf管，吸頭等），都要反復(fù)用水洗干凈，最后用ddH2O清洗，濕熱滅菌，置50溫箱中烘干，使用前打開包裝，用鑷子夾取，不直接用手去拿，嚴(yán)防手上雜酶污染。4、當(dāng)樣品在37與65保溫時(shí)，請(qǐng)注意防止因蓋子

49、未蓋嚴(yán)密使水汽進(jìn)入管內(nèi)，使溶液體積大量增加而造成實(shí)驗(yàn)失敗。同時(shí)要防止由于標(biāo)簽脫落而分不清樣品類型。附錄五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組DNA分子的轉(zhuǎn)化一、原理：重組DNA轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化效率的高低與受體菌的感受態(tài)有關(guān)。所謂感受態(tài)，就是細(xì)菌具有吸收周圍環(huán)境中的DNA的生理狀態(tài)。關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說法很多，目前主要兩種假設(shè)：1、局部原生質(zhì)體化假說，即認(rèn)為是由于細(xì)菌表面的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，使DNA分子能通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞；2、酶受體假說，認(rèn)為感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種感受態(tài)的細(xì)胞使極少數(shù)。而只有感受態(tài)的細(xì)胞才能穩(wěn)定地收取外源DNA分子。而且感受

50、態(tài)是在短暫時(shí)間內(nèi)發(fā)生地。一般出現(xiàn)在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長的后期。作為基因工程的受體菌必須是基因重組缺陷突變體，必須能同外來DNA分子發(fā)生遺傳重組，同時(shí)它們又必須是限制系統(tǒng)缺陷或限制與修飾系統(tǒng)均缺陷的菌株。使外來基因（DNA）不受其限制酶的降解，這樣才能進(jìn)行遺傳操作。受體菌的感受態(tài)往往通過CaCl2處理而獲得。DNA分子轉(zhuǎn)化的復(fù)雜過程如下：1、吸附：完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌的表面；2、轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈。單鏈DNA分子進(jìn)入受體菌，另一條鏈被降解；3、自穩(wěn)：外源質(zhì)粒DNA分子在受體菌內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA；4、表達(dá)：外源基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄翻譯。對(duì)DNA分子來說，成功轉(zhuǎn)化的比率極

51、小，僅占DNA分子的0.01%。二、操作步驟：（一）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法) 1、從新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一單菌落，接種于35mL LB液體培養(yǎng)中，37振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對(duì)數(shù)生長期。將該菌懸液以1:1001:50轉(zhuǎn)接于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔2030min測(cè)一次OD600nm，至OD600nm0.5時(shí)停止培養(yǎng)；2、每組取培養(yǎng)液2個(gè)1.5mL轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4，4000rmin離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）；3、倒凈上清培養(yǎng)液，用

52、1mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰?。?、04，4000rmin離心10min；5、棄去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞。04，4000rmin離心10min；6、棄去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；7、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入占總體積15左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5mL離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。（二）細(xì)胞轉(zhuǎn)化1、分別取3個(gè)100l感受態(tài)細(xì)胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作)，第一組，加入10 l重組質(zhì)粒DNA(體積不超過10l)+ 100l感受態(tài)細(xì)胞，此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。第二組，插入DNA片段對(duì)照組，即酶切后DNA片段25ng+100l感受態(tài)細(xì)胞懸液；第三組，質(zhì)粒DNA對(duì)照組，即1ng 未