原位制備納米功能化金電極快速檢測牛奶中的微生物

1、原位制備納米功能化金電極快速檢測牛奶中的微生物    摘 要 HTSS在0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS, pH 7.0）中，于2.0 V恒電位電解10 min，即可在金電極表面原位、快速制備納米功能化修飾膜。經(jīng)原子力顯微鏡表征，此修飾膜具有納米尺度的蓬松結(jié)構(gòu)。此納米金膜對細胞膜上脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有顯著的催化作用，因而對細菌產(chǎn)生電流響應(yīng)。采用傳統(tǒng)的標準平板計數(shù)法對試樣進行細菌培養(yǎng)計數(shù)作為校正，以計時電流法電流響應(yīng)作為輸出信號進行細菌的測定，響應(yīng)電流和細菌數(shù)量呈線性關(guān)系，據(jù)此可對牛奶樣品中細菌濃度進行快速測定。本方法的測定范圍為1.1×

2、1032.5×107 cfu/mL，檢測時間縮短至1 h以內(nèi)，較平板計數(shù)法有顯著改善。    KH*3/4DHTH關(guān)鍵詞 HTSS納米功能化金電極; 微生物; 快速檢測; 脂質(zhì)過氧化; 計時電流法    HTHK    FQ（3,X,DYCD15 20110826收稿；20111219接受    本文系蘇州市科技局項目（No. YJC0910） 及常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文） 團隊課題項目資助   

3、; * Email: tuyf；wxy62HT    1 引 言    牛奶為人類生活中價值最高的營養(yǎng)物質(zhì)之一，但易酸敗變質(zhì)1。我國90以上的奶牛由農(nóng)民飼養(yǎng)，規(guī)模小、生產(chǎn)水平低、衛(wèi)生設(shè)備不足，因而很多牛奶原料達不到一級標準。在牛奶的生產(chǎn)、運輸、銷售過程中，還可能受到多種細菌的污染，其中含有很多潛在的有害微生物，這些微生物不僅破壞牛奶質(zhì)量，而且可能危害飲用者身體健康24。傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)非常繁瑣，需要耗費大量的人力物力，而且檢測周期長。按國標GB/T 4789.2進行菌落總數(shù)檢測需要48 h才能得出結(jié)果

4、，難以滿足食品安全檢測的要求。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）5、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）6,7等幾種快速檢測技術(shù)通過富集、分離、形態(tài)學(xué)檢測、生物化學(xué)測試來鑒別食品中致病菌，縮短了檢測時間，但檢測費用高、儀器昂貴。電化學(xué)阻抗技術(shù)亦可應(yīng)用于細菌的檢測，但在分析含菌量較少樣品時，檢測時間較長，且只有當(dāng)微生物數(shù)目達到106107個/mL時，這種電阻的變化才能被記錄到8,9。因此，開發(fā)快速、簡易的適合于牛奶樣品中細菌檢測的方法具有十分重要的意義。電化學(xué)分析方法在這方面具備獨特優(yōu)勢1012，所需設(shè)備簡單、操作簡便易行、測定速度快、檢測成本低，可望開發(fā)出實用的檢測技術(shù)。   &#

5、160;納米材料因具有高比表面積、高催化活性等獨特性質(zhì)而備受關(guān)注，對許多物質(zhì)有很高的電催化效應(yīng)。納米修飾技術(shù)在電化學(xué)分析方面亦得到了廣泛的應(yīng)用1315。通過表面修飾或功能化獲得的化學(xué)修飾電極在分析性能上較傳統(tǒng)電極取得了長足的進步，從而為開發(fā)適合于特定目標的檢測技術(shù)奠定了良好的基礎(chǔ)。    納米功能化電極表現(xiàn)出巨大的潛在應(yīng)用前景，特定的納米修飾電極可催化H2O轉(zhuǎn)化成羥基自由基（·OH），·OH具有極高的反應(yīng)活性，可以使微生物細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化16，在電極上產(chǎn)生氧化電流，且電流的大小與微生物的量成線性關(guān)系，通過電流檢測實現(xiàn)對微生物的定量

6、檢驗。文獻11應(yīng)用此原理成功地進行了水體中大腸桿菌（E. coli）的檢測。本研究采用控制電位電解法，以中性的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）為電解質(zhì)，一步操作實現(xiàn)對金電極表面的納米功能化修飾，使其表面形成一層蓬松的納米級粗糙層，并應(yīng)用于牛奶中微生物的檢測。制備方法簡便，線性范圍為1.1×1032.5×107 cfu/mL，檢測時間縮短至1 h以內(nèi)。本方法重復(fù)性好、靈敏度高、不需要預(yù)處理，有望在牛奶及其它食品的微生物檢測中得到應(yīng)用。    2 實驗部分    2.1 儀器、材料與試劑 

7、0;  CHI660C 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；金電極（2 mm）為工作電極，鉑電極（2 mm）為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極；Dimension Icon原子力顯微鏡 （美國Bruker 公司）；UV3600紫外可見分光光度計（日本島津公司）；YX400Z型電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；S·SWCJ·2F型超凈工作臺（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）；303A3S型電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）。    0.1 mol/L PBS溶液，pH分別為7.0和7.4

8、。LB 培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。大腸桿菌、嗜熱鏈球菌、金黃色葡萄球菌由常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心提供。牛奶樣品由常熟市圣力乳業(yè)有限公司提供。實驗用水均為二次蒸餾水。    2.2 納米功能化金電極的制備及表征    金電極用0.3 和0.05    SymbolmA m的A12O3粉拋光，依次在HNO3（11, V/V）、無水乙醇及二次蒸餾水中超聲清洗5 min，紅外燈下烘干。上述電極

9、置于0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.0）中,于2.0 V恒電位電解600 s; 在01.5 V范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描至電流穩(wěn)定; 用水反復(fù)沖洗，并儲存在水中備用。采用原子力顯微鏡表征納米功能化修飾膜的表面形貌。采用亞甲基藍檢驗法驗證納米功能化金電極的性能：用PBS溶液將8 mL 0.15 mmol/L亞甲基藍溶液釋至100 mL，分別以裸金電極和納米功能化金電極為工作電極，在1.0 V恒電位電解30 min，分別測定原溶液和電解后溶液的吸收光譜曲線。     分 析 化 學(xué)第40卷    第5期汪學(xué)英等： 原

10、位制備納米功能化金電極快速檢測牛奶中的微生物     2.3 細菌總數(shù)的測定方法     大腸桿菌（E. coli）是生物腸道內(nèi)和環(huán)境中最普遍存在，且最大量的細菌，通常作為細菌研究的模式生物。牛奶中的細菌總數(shù)在很大程度上決定于環(huán)境衛(wèi)生、擠奶機、牛奶貯存和運輸設(shè)備的清潔程度和牛奶的冷藏溫度等因素，因此大腸桿菌是最可能存在的細菌。健康奶牛的乳房內(nèi)也總存在一些細菌，但僅限于少數(shù)幾種細菌，如小球菌、鏈球菌等，細菌數(shù)量約為102個/mL；如奶牛發(fā)生乳房炎，則在奶中會檢出大量的金黃色葡萄球菌、鏈球菌和化膿桿菌等致病菌。因此，本

11、研究主要以大腸桿菌作為研究對象，并分別考察大腸桿菌、嗜熱鏈球菌、金黃色葡萄球菌的響應(yīng)，以進行比較，評估本方法對檢測不同種類細菌的適用性。    2.3.1 平板計數(shù)法 參照GB 4789.22010 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定進行。    2.3.2 計時電流法 于37 恒溫水浴中，用無菌移液管準確移取10 mL經(jīng)高壓滅菌的0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）于電解池內(nèi)，以納米功能化金電極為工作電極、鉑電極為對電極、飽和甘汞電極為參比電極，恒電位1.0 V進行計時電流測定，記錄加入一

12、定量樣品后產(chǎn)生的電流響應(yīng)值。    2.3.3 校正曲線與定量測定 對同一樣品用標準平板計數(shù)法和計時電流法同時進行測定，得到電流響應(yīng)和牛奶中細菌數(shù)量的對應(yīng)關(guān)系，建立校正曲線。根據(jù)儀器測定的相應(yīng)樣品的電流響應(yīng)，計算每毫升樣品細菌數(shù)量。2.4 電極的活化再生    由于電極表面是納米尺度粗糙結(jié)構(gòu)，具有較強的吸附性，測定中細菌氧化產(chǎn)物會吸附在電極上，所以測定中電流響應(yīng)會逐步減小。因此，每次測定后需對電極進行活化再生處理。處理方法是用PBS液沖洗后，再在其中于2.0 V電解產(chǎn)生氧氣，利用氧氣帶走細菌被氧化的中間產(chǎn)物，從而使

13、電極重新活化。3 結(jié)果與討論3.1 納米功能化金電極的性能和作用機理    采用AFM技術(shù)對納米功能化金電極表面形貌進行表征。從圖1可見，經(jīng)陽極氧化活化處理后，電極表面形成了蓬松的結(jié)構(gòu)。這是由于金電極表面吸附的·OH或O與Au原子發(fā)生交換，進入電極表層所致，電極表面的吸附的·OH或O和Au原子具有較強的活性17。    TS（HT5”SS 圖1 金電極納米功能化表面的原子力顯微鏡圖（A）三維形貌，（B）2    SymbolmA m尺度，（C）500 nm

14、尺度    Fig1 Surface morphology of nanofunctionalized gold electrode （A） 3D AFM image, （B） at scale of 2    SymbolmA m and （C） at scale of 500 nmHT                   TS）圖2A為所制備納米功能化金

15、電極在0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中的循環(huán)伏安圖。在修飾電極上，除了在電位約為1.5 V處因產(chǎn)生氧氣而使電流增大外，還出現(xiàn)一對很強的氧化還原峰（a），而普通金電極幾乎不出峰（b）。據(jù)文獻報道，電流的增加主要是因為在納米功能層的催化下生成了·OH，且·OH被吸附于電極表面，占據(jù)著電極表面的活性位點17,18，其反應(yīng)如下：Au*H2OAu*OH（1Symbolm n）Symbolm adsHeAu*OHAu*OH（1Symbolm m）Symbolm adseTS（HT5”SS圖2 （A） 納米功能化金電極（a）及裸金電極（b）在0.1 mol/L PBS溶液

16、（pH 7.4）中的循環(huán)伏安曲線（掃速：100 mV/s），（B） 1.2×10Symbolm 5 mol/L亞甲基藍溶液（a）及經(jīng)裸金電極（b）或納米功能化金電極（c）電解30 min后的吸收光譜Fig2 （A） Cyclic voltammograms of （a） nanofunctionalized gold electrode and （b） bare Au electrode in phosphate buffer （pH 7.0, scan rate:100 mV/s）; （B） Absorption spectra of 1.2×10Symbolm 5 mo

17、l/L methylene blue （MB ） （a） and electrolyzed for 30 min with bare Au electrode （b） or nanofunctionalized gold electrode （c） as working electrodeHTTS）圖2B采用亞甲基藍檢驗法進行了驗證。呈藍色的亞甲藍溶液遇到強氧化劑時失電子形成無色的3,7雙二甲氨基吩噻嗪離子，通過亞甲藍溶液吸光度的變化可確定·OH的含量19。以裸金電極電解30 min后亞甲基藍溶液,吸光度（b）較原溶液（a）下降并不明顯; 以納米功能化金電極電解后,亞甲基藍溶液吸光度

18、值較電解前明顯減?。╟），說明在此條件下，修飾電極上產(chǎn)生了·OH，使亞甲基藍失電子形成無色的3,7雙二甲氨基吩噻嗪離子。細菌細胞膜主要由脂類和蛋白質(zhì)組成的雙層膜結(jié)構(gòu)，其脂質(zhì)分子相當(dāng)穩(wěn)定，但當(dāng)有活潑自由基存在時，就可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化16，從而在電極上產(chǎn)生電流。當(dāng)將修飾電極置于含菌的PBS溶液中，電極表面活性位點的羥基自由基將會引起細菌細胞膜的脂質(zhì)過氧化，細菌數(shù)量越多，產(chǎn)生的氧化電流越大。因此，可以根據(jù)氧化電流的變化與細菌數(shù)量變化的關(guān)系對牛奶中細菌總數(shù)進行快速檢測。3.2 測定條件的優(yōu)化考察了計時電流檢測工作電位及pH值對測定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖3）表明，隨著電壓的增大，響應(yīng)電流隨之變大

19、。但當(dāng)電位超過1.0 V時，電流不穩(wěn)定，故選擇測定電位為1.0 V。在所研TS（HT5”SS圖3 （A）檢測電位及（B）pH值對測定響應(yīng)的影響Fig3 Effect of （A） applied potential and （B） pH value of buffer solution on detection response25SymbolpB C，在0.1 mol/L PBS溶液，含菌量約1.1×106 cfu/mL。Temperature: 25SymbolpB C, substrate solution: 0.1 mol/L phosphate buffer contain

20、ing 1.1×106 cfu/mL of bacteria.HTTS）究范圍內(nèi)，隨pH值增大，氧化電流變化值增加，至pH=8時達到一個平臺。但此時穩(wěn)定性變差，故最佳pH值選取為7.4。3.3 電極對細菌的響應(yīng)特性在選定的最佳工作條件下，向10 mL 0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中依次加入10SymbolmA L含1.1×106 cfu/mL細菌懸濁液，修飾電極上的計時電流曲線見圖4，表明修飾電極催化細菌脂質(zhì)過氧化速度很快，可用于細菌的快速檢測。培養(yǎng)基中的共存組分的干擾情況如圖5所示： NaCl、瓊脂對測定無影響；10 mL PBS溶液中加入100Symb

21、olmA L的蛋白胨、牛肉膏、牛奶時，電流響應(yīng)略有波動，但并不產(chǎn)生明顯的電流響應(yīng)，故亦不影響測定。分別考察了加入含550和1100 cfu/mL混合菌的牛奶，及分別加入同濃度的大腸桿菌、嗜熱鏈球菌和金黃色葡萄球菌的牛奶懸液后的電流響應(yīng)， 從圖5可見，等量不同種類的細菌產(chǎn)生的響應(yīng)值基本相同，表明本方法對各種不同的細菌產(chǎn)生基本相同的響應(yīng)，而牛奶等基質(zhì)不產(chǎn)生響應(yīng)，因而可作為牛奶中細菌總濃度的測定方法。TS（HT5”SS 圖4 修飾電極對細菌響應(yīng)的計時電流曲線，插圖A為電極響應(yīng)對細菌總數(shù)的校正曲線Fig4 Chronoamperometric curve of response upon the ad

22、ition of bacteria. Inset is calibration curve of current response versus concentration of bacteriaHTTS）TS（HT5”SS 圖5 培養(yǎng)基成分及等濃度不同細菌的電流響應(yīng)Fig5 Current response of culture medium constitution and different bacteriaa, b為550、1100 cfu/mL的混合菌；c, d, e 分別為1100 cfu/mL的大腸桿菌，嗜熱鏈球菌，金黃色葡萄球菌。a, b mixed bacteria at c

23、oncentrations of 550, 1100 cfu/mL respectively; c, d, e Escherichia coli, Streptococcus thermophilus and Staphylococcus aureus respectively, at concentration of 1100 cfu/mLHTTS）3.4 電極分析性能及對實際樣品中細菌總數(shù)的測定以計時電流法進行牛奶樣品中細菌總數(shù)的測定，同時用平板計數(shù)法進行對照，建立校正曲線 （圖4A），其回歸方程為：i （nA）1.43 logCSymbolm 4.58 （C為樣品中細菌的濃度，單位：cf

24、u/mL），電流響應(yīng)與細菌濃度在1.1×1032.5×107 cfu/mL范圍內(nèi)呈良好的線性（9*2。19*2，HT5”SS*4表1 本方法與平板計數(shù)法檢測大腸桿菌樣品結(jié)果比較Table 1 Comparison of analytical results obtainedfrom present method and GB （national standard） methodHT6SSBG（BHDFG3,WK，7。，樣品Sample本方法Present method國家標準方法GB Method相對誤差RE（%）152060482008.025576859500Symbo

25、lm 6.3361180570007.341536001470004.551367501300005.2BG）FHT關(guān)系，r0.9959。制備5份牛奶樣品，用本方法進行測定，對每個樣品平行測定5次，并與GB4789平板菌落計數(shù)法相對照，結(jié)果見表1。從表1可見，用2種方法測定5個樣品， 其最大相對誤差為8.0%；同時采用t檢驗法判斷 2種方法所得結(jié)果之間并無顯著性差異（t1.375t0.052.776）；電極經(jīng)活化再生處理后重復(fù)使用所得相對標              

26、0;    準偏差（RSD）為2.9%。結(jié)果表明，本研究制備的納米功能化修飾金電極的方法簡便，性能穩(wěn)定，電極可更新，使用壽命長。本修飾電極用于牛奶中細菌總數(shù)的測定是可行的。將此電極用于牛奶中細菌的測定相比于傳統(tǒng)生物學(xué)方法更簡單、快速和準確，大大縮短了分析時間，且檢出限低，具有一定的推廣應(yīng)用價值。References1 Abdullah D A, Saby A H. Food Control, 2009, 20（10）: 9139172 Johnson E A, Nelson J H, Johnson M. J. Food Prot., 1990, 53（5）: 4

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33、ing*1, GU Feng1, YIN Fan1, TU YiFeng*21（Department of Chemistry, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China）2（Institute of Analytical Chemistry, Soochow University, Suzhou 215123, China）Abstract An insitu, facile and rapid method was developed to prepare a nanofunctionalized gold elect

34、rode. By the electrolysis under applied potential of 2 V in PBS of pH 7.0 for 10 min, a rough nanoporous film formed on the surface of a polished gold plate electrode. This novel nanofunctionalized gold electrode could be applied for rapid detection of bacteria quantity in milk. The detection was ba

35、sed on the catalysis of lipid peroxidation on cell membrane of bacteria by the nanoporous Au film. The response of the current in chronoamperometry would linearly respond the bacterial content in milk which was calibrated by the national standard method （Standard plate count method）. Therefore the accurate quantity of bacteria was attained from the current response on prepared elec