分子生物學(xué)研究方法下

1、.6. 1 基因表達(dá)研究技術(shù)基因表達(dá)研究技術(shù) 6. 1. 1 基因表達(dá)系列分析技術(shù)（基因表達(dá)系列分析技術(shù)（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是以是以DNA序列測定為基礎(chǔ)分析全基因組表序列測定為基礎(chǔ)分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)。任何長度超過達(dá)模式的技術(shù)。任何長度超過9-10個堿基個堿基的核的核 苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個序列占總標(biāo)簽數(shù)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個序列占總標(biāo)簽數(shù)的比例的比例 可分析所對應(yīng)基因的表達(dá)頻率?？煞治鏊鶎?yīng)基因的表達(dá)頻率。.圖圖6-1常規(guī)常規(guī)SAGE方方法（法（short S

2、AGE）基本流程基本流程. LongSAGE技術(shù)技術(shù) 標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物3端一段端一段21bp的序列，可的序列，可以進(jìn)行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹以進(jìn)行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。其原理與配。其原理與ShortSAGE方法類似，只是方法類似，只是用了不同的用了不同的IIS類標(biāo)簽酶（類標(biāo)簽酶（MmeI），并將程），并將程序做了相應(yīng)修改。序做了相應(yīng)修改。.6.1.2 RNA的選擇性剪接技術(shù) RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接剪接異構(gòu)體的過程?？煞譃椋浩胶饧羟小悩?gòu)體的過程。可分為：平

3、衡剪切、5選擇選擇性剪切、性剪切、3選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。及相互排斥性剪切。.圖圖6-2選擇性剪接的不同類型選擇性剪接的不同類型平衡剪接平衡剪接3選擇性剪接選擇性剪接外顯子遺漏外顯子遺漏相互排斥性剪接相互排斥性剪接5選擇性剪接選擇性剪接.圖圖6-3 RT-PCR檢測檢測5個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切.6.1.3原位雜交技術(shù). 熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH).首先對寡核苷酸探首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交

4、針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該來確定該DNA序列在染色體上的位置。序列在染色體上的位置。.6.1.4基因定點(diǎn)突變基因定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis). 通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造及結(jié)合配體

5、能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。引入新的酶切位點(diǎn)等。.圖圖6-6寡核苷酸寡核苷酸介導(dǎo)的介導(dǎo)的DNA突突變技術(shù)變技術(shù). 目前，主要采用兩種目前，主要采用兩種PCR方法，方法， 重疊延伸技術(shù)重疊延伸技術(shù) 大引物誘變法，大引物誘變法， 在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。.圖圖6-7重疊延伸介重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變導(dǎo)的定點(diǎn)誘變.圖圖6-8大引物誘變法示意圖大引物誘變法示意圖.PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法的優(yōu)勢介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法的優(yōu)勢 1.突變體回收率高突變體回收率高 2.能用雙鏈能用雙鏈DNA作為模板，可在

6、任何位點(diǎn)作為模板，可在任何位點(diǎn)引入突變引入突變 3.可在同一試管中完成所有反應(yīng)可在同一試管中完成所有反應(yīng) 4.快速簡便快速簡便.6.2基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù) 6.2.1基本原理基本原理 經(jīng)典遺傳學(xué)（經(jīng)典遺傳學(xué)（Forward genetics）是從一）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列。而找出該基因的編碼序列。 現(xiàn)代遺傳學(xué)（現(xiàn)代遺傳學(xué)（Reverse genetics，反向遺，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能。型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能。. 基因敲除（基因

7、敲除（gene knock-out）又稱基因打）又稱基因打靶，通過外源靶，通過外源DNA與染色體與染色體DNA之間的同之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。. 基因敲除分為基因敲除分為 完全基因敲除：是指通過同源重組法完全完全基因敲除：是指通過同源重組法完全 消除細(xì)胞或者動物個體中的靶基因活性消除細(xì)胞或者動物個體中的靶基因活性 條件型基因敲除：（又稱不完全基因敲條件型基因敲除：（又稱不完全基因敲 除），是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特除），是指通

8、過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特 定時間和空間的基因敲除。定時間和空間的基因敲除。. 噬菌體的噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)和系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。.圖圖6-9用取代型（用取代型（a）或插入型（）或插入型（b）載體進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)載體進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)1. 完全基因敲除完全基因敲除.圖圖6-10正負(fù)篩選法（正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞. 由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然

9、發(fā)生率極低，由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率約為動物的重組概率約為10-210-5，植物的概，植物的概率為率為10-410-5，即使采用雙向選擇法也很，即使采用雙向選擇法也很難保證一次就從眾多細(xì)胞中篩選出真正發(fā)難保證一次就從眾多細(xì)胞中篩選出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞，得用多種分生了同源重組的胚胎干細(xì)胞，得用多種分子篩選技術(shù)驗(yàn)證所獲得的確實(shí)是目的基因子篩選技術(shù)驗(yàn)證所獲得的確實(shí)是目的基因被敲除的細(xì)胞系。被敲除的細(xì)胞系。. 構(gòu)建條件型基因敲除打靶載體，將正向選擇標(biāo)構(gòu)建條件型基因敲除打靶載體，將正向選擇標(biāo)記記neo置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶

10、基因重要功能域兩側(cè)內(nèi)含子中插入同向功能域兩側(cè)內(nèi)含子中插入同向LoxP位點(diǎn)。位點(diǎn)。 需要消除靶基因活性時，與帶有需要消除靶基因活性時，與帶有Cre重組酶基重組酶基因的因的ES細(xì)胞雜交，細(xì)胞雜交，Cre可把兩個可把兩個LoxP位點(diǎn)間的位點(diǎn)間的DNA片段切除，導(dǎo)致靶基因失活。也可用片段切除，導(dǎo)致靶基因失活。也可用Cre表表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶ES細(xì)胞，通過重組將兩個細(xì)胞，通過重組將兩個LoxP位點(diǎn)間序列刪除（包括位點(diǎn)間序列刪除（包括neo基因）?；颍?。2. 條件型基因敲除條件型基因敲除.利用利用CreLoxP實(shí)現(xiàn)靶基因的切除原理實(shí)現(xiàn)靶基因的切除原理.6.2.2高等動物基因敲除技術(shù)高等動物基

11、因敲除技術(shù) 真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。.圖圖6-12模式動物小鼠中模式動物小鼠中完全基因敲除的主要技完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用。術(shù)策略與應(yīng)用。.圖圖6-13 基因捕獲法原理示意圖基因捕獲法原理示意圖.

12、顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。方便。 胚胎干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。.6.2.3植物基因敲除技術(shù) T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。最為廣泛的基因敲除手段。 利用根癌農(nóng)桿菌利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報告基因的報告基因的DNA序列整合到基因組序列整合到基因組DNA上，上

13、，如果這段如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達(dá)，從而使該基因就會影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活失活”。.a.引物設(shè)計。引物設(shè)計。LP和和RP分別代表插入基分別代表插入基因兩端的引物，因兩端的引物，LB是指載體上的一段是指載體上的一段引物，目的基因片引物，目的基因片段段(設(shè)為設(shè)為900bp)。旁。旁鄰序列是經(jīng)測序后鄰序列是經(jīng)測序后獲得的獲得的DNA序列。序列。b，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生果。分別代表野生型、雜合子和純合型、雜合子和純合子子PCR條帶。條帶。.6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù) 6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)（酵母單

14、雜交系統(tǒng)（Yeast one-hybrid system） 是上世紀(jì)是上世紀(jì)90年代中發(fā)展起來的研究年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，可識別穩(wěn)定白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，可識別穩(wěn)定結(jié)合于結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細(xì)胞內(nèi)研上的蛋白質(zhì)，在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。作用蛋白的編碼基因。.圖圖6-15酵母單雜交的基本原理示意圖酵母單雜交的基本原理示意圖.圖圖6-16從擬從擬南芥南芥cDNA文庫中篩選文庫中篩選與順式元件與順式

15、元件DRE結(jié)合的結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示轉(zhuǎn)錄因子示意圖。意圖。.6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system） 真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征，這些蛋白往往由兩個）特征，這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，其中或兩個以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（結(jié)合結(jié)構(gòu)域（binding domain，BD）和轉(zhuǎn)）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。. BD能與特定基因啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活能

16、與特定基因啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄，由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因轉(zhuǎn)錄，由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。功能。.圖圖6-17酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖.6.3.3體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù) 1、Far Western印跡技術(shù)印跡技術(shù) 用用32P標(biāo)記的體外表達(dá)蛋白作探針標(biāo)記的體外表達(dá)蛋白作探針,直接檢直接檢測與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達(dá)該測與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達(dá)該蛋白的蛋白的cDNA。.2、GST融合蛋白沉降技術(shù)融合蛋白沉降技術(shù) 利用利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂

17、糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白?；プ饔玫鞍住?圖圖6-19 GST融合融合蛋白沉降技術(shù)流程。蛋白沉降技術(shù)流程。.3、蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標(biāo)記的探針蛋白與蛋的相互作用。將熒光標(biāo)記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點(diǎn)檢測到后，可以通過掃描芯片上的熒光點(diǎn)檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點(diǎn)。穩(wěn)定的相互作用蛋白點(diǎn)。.4、等離子表面共振技術(shù) 將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納將誘餌蛋白結(jié)合

18、于葡聚糖表面并固定于納米級厚度的金屬膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)米級厚度的金屬膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌誘餌”蛋白發(fā)生蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。.圖圖6-21等離子表面共振技術(shù)示意圖等離子表面共振技術(shù)示意圖.5、免疫共沉淀技術(shù).靶蛋白抗體靶蛋白抗體固體基質(zhì)固體基質(zhì)待篩選蛋白待篩選蛋白低離心力沉淀或微膜過濾低離心力沉淀或微膜過濾親和反應(yīng)親和反應(yīng)反應(yīng)體系反應(yīng)體系靶蛋白抗體靶蛋白抗體待篩選蛋白待篩選蛋白相互作用相互作用沉淀得到待篩選蛋白沉淀

19、得到待篩選蛋白圖圖 6-22 免疫共沉淀免疫共沉淀示意圖示意圖.6.3.4細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET） FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件： （1）給體與受體在合適的距離（）給體與受體在合適的距離（110nm）；）； （2）給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定）給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；的重疊（這是能量匹配的條件）； （3）給體與受體的偶極具有一定的空間取向）給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。偶極耦合作用的條件）。. FRET需要有兩個探針，即熒光給體和熒光

20、需要有兩個探針，即熒光給體和熒光受體，要求給體的發(fā)射光譜與受體的吸收受體，要求給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊，而與受體的發(fā)射光譜光譜有一定的重疊，而與受體的發(fā)射光譜盡量沒有重疊。不同蛋白的吸收和發(fā)射波盡量沒有重疊。不同蛋白的吸收和發(fā)射波長不同，可根據(jù)需要組成不同的探針對。長不同，可根據(jù)需要組成不同的探針對。常用的探針有：常用的探針有： 熒光蛋白熒光蛋白 傳統(tǒng)有機(jī)染料傳統(tǒng)有機(jī)染料 鑭系染料鑭系染料. 熒光蛋白，一類能發(fā)射熒光的天然蛋白及熒光蛋白，一類能發(fā)射熒光的天然蛋白及其突變體。其突變體。 傳統(tǒng)有機(jī)染料，具有特征吸收和發(fā)射光譜傳統(tǒng)有機(jī)染料，具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機(jī)化合物組成的染

21、料對。包括熒光素、的有機(jī)化合物組成的染料對。包括熒光素、羅丹明類化合物和青色染料羅丹明類化合物和青色染料Cy3、Cy5等。等。 鑭系染料，金屬染料。一般與有機(jī)染料聯(lián)鑭系染料，金屬染料。一般與有機(jī)染料聯(lián)用，分別作為用，分別作為FRET的給體或受體，以提高的給體或受體，以提高檢測的準(zhǔn)確性和信噪比。檢測的準(zhǔn)確性和信噪比。.圖圖6-23熒光共振能量轉(zhuǎn)移法熒光共振能量轉(zhuǎn)移法.6.3.5 RNAi（RNA interference,RNA干涉）技術(shù)及其應(yīng)用 RNAi技術(shù)利用雙鏈小技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出

22、現(xiàn)靶基因缺失的表型。使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命的命名來源于安德魯名來源于安德魯法爾法爾1998年在年在自然自然雜雜志上的論文。志上的論文。. 研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是是RNAi的觸發(fā)物，引的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA（ssRNA,single-stranded RNA）的降解。經(jīng)過）的降解。經(jīng)過Dicer（一種（一種具有具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，細(xì)活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長的雙鏈胞中較長的雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首個核苷酸以上）首先被降解形成先被降解形成2125個核苷酸的小分子干擾個核苷酸的小分子干擾核糖核酸（核糖

23、核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目標(biāo)），并有效地定位目標(biāo)mRNA。. siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性性RNA降解的重要中間媒介，它具有特殊降解的重要中間媒介，它具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即的結(jié)構(gòu)特征，即5端磷酸基團(tuán)和端磷酸基團(tuán)和3端的羥基，端的羥基，其兩條鏈的其兩條鏈的3端各有兩個堿基突出于末端。端各有兩個堿基突出于末端。由由siRNA中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核蛋白）的核蛋白體，再由體，再由RISC介導(dǎo)切割目的介導(dǎo)切割目的mRNA

24、分子中分子中與與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。擾靶基因表達(dá)的功能。.圖圖 6-24 RNAi作作用機(jī)制示意圖。用機(jī)制示意圖。.6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析 基因芯片（基因芯片（DNA chip），又稱），又稱DNA微陣列微陣列（DNA microarray）技術(shù)是能同時監(jiān)測大）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，從而迅速準(zhǔn)確量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。.6.4.1 基因芯片技術(shù)原理基因芯片技術(shù)原理 把大量已

25、知或未知序列的把大量已知或未知序列的DNA片段點(diǎn)在尼片段點(diǎn)在尼龍膜或玻璃片上，再經(jīng)過物理吸附作用達(dá)龍膜或玻璃片上，再經(jīng)過物理吸附作用達(dá)到固定化。也可以直接在玻璃板或金屬表到固定化。也可以直接在玻璃板或金屬表面進(jìn)行化學(xué)合成，得到寡聚核苷酸芯片。面進(jìn)行化學(xué)合成，得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的將芯片與待研究的cDNA或其他樣品雜交，或其他樣品雜交，經(jīng)過計算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察經(jīng)過計算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到成千上萬個基因在不同組織或同一組織到成千上萬個基因在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)模不同發(fā)育時期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。式。.6-25基因芯片技術(shù)流程

26、圖基因芯片技術(shù)流程圖.1.簡易基因芯片簡易基因芯片 使用機(jī)械臂把使用機(jī)械臂把DNA片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過物理吸附作用達(dá)到固定化。也膜上，經(jīng)過物理吸附作用達(dá)到固定化。也可以直接在玻璃板表面進(jìn)行化學(xué)合成，從可以直接在玻璃板表面進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機(jī)掃描或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)調(diào)控情況。不同生理?xiàng)l件下的

27、表達(dá)調(diào)控情況。. 簡易芯片一般基因數(shù)量少（一般不超過簡易芯片一般基因數(shù)量少（一般不超過2000），主要用于研究小部分特定基因的），主要用于研究小部分特定基因的表達(dá)狀態(tài)。可用手工制作或者機(jī)械手點(diǎn)樣。表達(dá)狀態(tài)?？捎檬止ぶ谱骰蛘邫C(jī)械手點(diǎn)樣。.圖圖6-26包包含含280個棉個棉花花cDNA的的簡易芯片的簡易芯片的雜交圖譜。雜交圖譜。.2.大規(guī)?；蛐酒笠?guī)模基因芯片 通常涉及基因組規(guī)模與數(shù)量（一般大于通常涉及基因組規(guī)模與數(shù)量（一般大于10000個基因），分別采用接觸式點(diǎn)樣，非個基因），分別采用接觸式點(diǎn)樣，非接觸式點(diǎn)樣或者半導(dǎo)體技術(shù)制備樣品。接觸式點(diǎn)樣或者半導(dǎo)體技術(shù)制備樣品。. 基因芯片的工作流程：基因

28、芯片的工作流程：（1）經(jīng)大規(guī)模）經(jīng)大規(guī)模PCR擴(kuò)增獲得獨(dú)立擴(kuò)增獲得獨(dú)立cDNA插入片段。插入片段。（2）用機(jī)械手將）用機(jī)械手將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在玻璃板上，變性，固定。產(chǎn)物點(diǎn)在玻璃板上，變性，固定。（3）分別從不同器官或組織中分離）分別從不同器官或組織中分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。（4）用不同的熒光染料標(biāo)記不同器官或組織的）用不同的熒光染料標(biāo)記不同器官或組織的cDNA。（5）將標(biāo)記后的）將標(biāo)記后的cDNA與點(diǎn)好的芯片進(jìn)行雜交。與點(diǎn)好的芯片進(jìn)行雜交。（6）激光掃描芯片雜交結(jié)果，計算機(jī)處理。）激光掃描芯片雜交結(jié)果，計算機(jī)處理。（7）分析芯片雜交數(shù)據(jù)。）分析芯片雜交數(shù)據(jù)。.大規(guī)?；蛐酒?/p>

29、的應(yīng)用大規(guī)模基因芯片的應(yīng)用.3.微珠芯片技術(shù) 在包含在包含50000根光纖的直徑為根光纖的直徑為3.5mm光纖光纖束中，每根光纖頂部蝕刻出的小洞可鑲嵌束中，每根光纖頂部蝕刻出的小洞可鑲嵌3m的微磁珠，每個微磁珠上可據(jù)要求連的微磁珠，每個微磁珠上可據(jù)要求連接不同的配體。配體可與熒光標(biāo)記的配體接不同的配體。配體可與熒光標(biāo)記的配體發(fā)生相互作用，發(fā)生的信號被激發(fā)后通過發(fā)生相互作用，發(fā)生的信號被激發(fā)后通過光纖傳遞到檢測器。光纖傳遞到檢測器。. 微珠芯片的優(yōu)勢：微珠芯片的優(yōu)勢： （1）密度高）密度高 （2）測試重復(fù)性好）測試重復(fù)性好 （3）定制方便）定制方便 微珠芯片的用途：微珠芯片的用途： （1） SN

30、P及基因型分析及基因型分析 （2）基因表達(dá)譜分析）基因表達(dá)譜分析 （3）蛋白組學(xué)研究）蛋白組學(xué)研究.6.4.3 基因芯片數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)可靠性分析 生物學(xué)意義分析. 1.數(shù)據(jù)可靠性分析數(shù)據(jù)可靠性分析 通過兩次平行雜交反應(yīng)，將每個基因通過兩次平行雜交反應(yīng)，將每個基因在兩個反應(yīng)中的表達(dá)水平做成對應(yīng)散點(diǎn)圖，在兩個反應(yīng)中的表達(dá)水平做成對應(yīng)散點(diǎn)圖，只要絕大多數(shù)基因的雜交結(jié)果都在只要絕大多數(shù)基因的雜交結(jié)果都在45斜線斜線附近，就說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。附近，就說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。 多個持家基因作為內(nèi)對照，持家基因多個持家基因作為內(nèi)對照，持家基因的反應(yīng)信號在兩種組織中不變，可確定其的反應(yīng)信號在兩種組織中不變，

31、可確定其他基因表達(dá)信號的相對值。他基因表達(dá)信號的相對值。. 2.生物學(xué)意義分析生物學(xué)意義分析 主要指通過分析芯片雜交數(shù)據(jù)，研究主要指通過分析芯片雜交數(shù)據(jù)，研究差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義。差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義。 將差異表達(dá)定位于不同的生物化學(xué)代將差異表達(dá)定位于不同的生物化學(xué)代謝途徑，研究基因芯片數(shù)據(jù)中可能具有生謝途徑，研究基因芯片數(shù)據(jù)中可能具有生物學(xué)意義的代謝途徑。物學(xué)意義的代謝途徑。.6.5 利用酵母鑒定靶基因功能利用酵母鑒定靶基因功能 6.5.1 酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡介酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡介 酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有與動植物細(xì)胞相酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有與動植物細(xì)胞相似

32、的結(jié)構(gòu)特征。似的結(jié)構(gòu)特征。 釀酒酵母有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞，是最早釀酒酵母有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞，是最早完成基因組完成基因組DNA全序列測定的真核生物。全序列測定的真核生物。 導(dǎo)入酵母細(xì)胞中的導(dǎo)入酵母細(xì)胞中的DNA即能以自主復(fù)制的分子形即能以自主復(fù)制的分子形式存在，也可被整合到基因組的方式存在。式存在，也可被整合到基因組的方式存在。 酵母中轉(zhuǎn)化酵母中轉(zhuǎn)化DNA的整合重組主要通過同源重組方的整合重組主要通過同源重組方式進(jìn)行，整合效率較高。式進(jìn)行，整合效率較高。. 酵母單倍體和二倍體的重大差異：酵母單倍體和二倍體的重大差異： 二倍體細(xì)胞直徑大約是單倍體的二倍體細(xì)胞直徑大約是單倍體的1.3倍

33、。倍。 二倍體細(xì)胞呈長形或卵圓形，單倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞呈長形或卵圓形，單倍體細(xì)胞通常接近圓形。通常接近圓形。 二倍體細(xì)胞按極性方向出芽，單倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞按極性方向出芽，單倍體細(xì)胞按軸線方向出芽，即出芽方式不同。按軸線方向出芽，即出芽方式不同。. 酵母細(xì)胞有三種交配型：酵母細(xì)胞有三種交配型： MATa MAT MATa/ 二倍體二倍體 不能與前兩種中的任何一種細(xì)胞交配不能與前兩種中的任何一種細(xì)胞交配單倍體單倍體. 二倍體酵母細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏的條件下能通二倍體酵母細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏的條件下能通過減數(shù)分裂形成單倍體的孢子。過減數(shù)分裂形成單倍體的孢子。 從單個孢子來源的所有細(xì)胞都帶有一套相從單個孢子來源

34、的所有細(xì)胞都帶有一套相同的染色體同的染色體DNA。.6.5.2 酵母基因轉(zhuǎn)化與性狀互補(bǔ)酵母基因轉(zhuǎn)化與性狀互補(bǔ) 利用利用Yip可以對酵母基因組中的任意基因進(jìn)可以對酵母基因組中的任意基因進(jìn)行精確的敲除（置換），帶有致死位點(diǎn)和行精確的敲除（置換），帶有致死位點(diǎn)和可能的外源功能互補(bǔ)基因的酵母二倍體細(xì)可能的外源功能互補(bǔ)基因的酵母二倍體細(xì)胞在饑餓條件下形成四分體孢子，通過四胞在饑餓條件下形成四分體孢子，通過四分體分析技術(shù)進(jìn)行觀測和研究。如果引入分體分析技術(shù)進(jìn)行觀測和研究。如果引入的外源基因具有互補(bǔ)突變點(diǎn)的功能，含有的外源基因具有互補(bǔ)突變點(diǎn)的功能，含有突變基因的單倍體可以存活，否則就不能突變基因的單倍體可以

35、存活，否則就不能存活。存活。. 基因置換法：基因置換法： 一步置換法一步置換法 兩步置換法兩步置換法.圖圖6一一32 “一步置換法一步置換法”制備醉母缺失突變體的流程圖制備醉母缺失突變體的流程圖.6.5.3 外源基因在酵母中的功能鑒定 將外源基因克隆于酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化將外源基因克隆于酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化野生型或突變酵母菌株，通過觀察酵母的野生型或突變酵母菌株，通過觀察酵母的表型變化或分析細(xì)胞中化學(xué)成分的變化即表型變化或分析細(xì)胞中化學(xué)成分的變化即可推測該基因的生物學(xué)功能可推測該基因的生物學(xué)功能. 6.5其它分子生物學(xué)技術(shù)其它分子生物學(xué)技術(shù) 1凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)?zāi)z滯緩實(shí)驗(yàn) 凝膠滯緩試驗(yàn)（凝膠滯緩試

36、驗(yàn)（gel retardation assay），），又叫作又叫作DNA遷移率變動試驗(yàn)（遷移率變動試驗(yàn)（DNA mobilit shift assay），是用于體外研究），是用于體外研究DNA與蛋與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。. 在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。應(yīng)縮短了。.方法：方法：同位素標(biāo)記待測的同位素標(biāo)記待測的DNA片段片段細(xì)胞提取物細(xì)胞提取物DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋白質(zhì)復(fù)合物探針探針DNA溫育溫育PAGE電泳電泳放射自顯影放射自顯影進(jìn)行進(jìn)行DNA凝膠分析凝膠分析 .擬南芥轉(zhuǎn)錄擬南芥轉(zhuǎn)錄因子與不同因子與不同DNA元件元件有不同的結(jié)有不同的結(jié)合能力。合能力。.2噬菌體展示技術(shù) 噬菌體是細(xì)菌病毒的總稱，英文為噬菌體是細(xì)菌病毒的總稱，英文為Bacteriophag