植物DNA的提取與鑒定

1、 圣誕快樂(lè)！圣誕快樂(lè)！ 第第7 7組組 組員：組員：楊曼楊曼、楊芳、朱晨、楊芳、朱晨實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆照莆誄TABCTAB法從植物葉片提取法從植物葉片提取DNADNA的原理和方的原理和方法法掌握掌握紫外光照射法鑒定紫外光照射法鑒定DNADNA的原理和方法的原理和方法實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：采用采用CTABCTAB法從植物葉片中提取法從植物葉片中提取DNADNA。采用紫外光照射法鑒定采用紫外光照射法鑒定DNADNA 1 1. .核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以以核核蛋白蛋白的形式存在。的形式存

2、在。 在制備核酸時(shí)，通過(guò)研磨破壞細(xì)胞壁在制備核酸時(shí)，通過(guò)研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核和細(xì)胞膜，使核蛋白蛋白被釋放出來(lái)。被釋放出來(lái)。 2 2. .CTABCTAB(hexadecyltrimethylammonium (hexadecyltrimethylammonium bromide,bromide,十六烷基三甲基溴化銨十六烷基三甲基溴化銨) )，是一，是一種陽(yáng)離子去污劑種陽(yáng)離子去污劑, ,具有從低離子強(qiáng)度溶液具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB(0.7mol/L Na

3、Cl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸沉淀核酸. .通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。核酸分離出來(lái)。 （CTABCTAB法的全稱法的全稱是十六烷基三甲基溴化銨法是十六烷基三甲基溴化銨法（Hexadecyltrimethy Ammonium BromideHexadecyltrimethy Ammonium Bromide）。）。實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 CTABCTAB提取提取緩沖液緩沖液 洗滌緩沖液洗滌緩沖液：( (76%76%乙醇，乙

4、醇，10mmol/L10mmol/L乙酸銨乙酸銨共共100ml100ml：76mL76mL無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇，0.077g0.077g乙酸銨，乙酸銨，加水到加水到100mL100mL) ) T E T E 緩 沖 液緩 沖 液 ( ( 1 0 m m o l / L T r i s - H C L 1 0 m m o l / L T r i s - H C L （pH7.4pH7.4），），1mmol/L EDTA 1mmol/L EDTA ) ) 氯仿氯仿- -異戊醇異戊醇（24 24 ：1 1） 70% 70% 乙醇乙醇 液氮液氮實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)器材冷凍高速離心機(jī)冷凍高速離心機(jī)臺(tái)式高速離心機(jī)臺(tái)

5、式高速離心機(jī)移液器移液器水浴鍋水浴鍋 3710037100 陶瓷研缽陶瓷研缽離心管離心管 50ml 50ml，有蓋，有蓋 離心管離心管 5ml 5ml和和1.5ml 1.5ml 小玻棒小玻棒 形狀為彎成鉤狀的形狀為彎成鉤狀的 天平天平 1 1 ，將將10mLCTAB10mLCTAB提取提取緩沖液加入緩沖液加入50mL50mL離心離心管中，置于管中，置于6060水浴中預(yù)熱。水浴中預(yù)熱。2 2 ，稱取稱取1.5g1.5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎倒入液氮，盡快將葉片研碎至成粉末至成粉末。3 3 ，取取1g1g粉末直接加入預(yù)熱的粉末直接加入預(yù)熱的CTAB

6、CTAB分離緩分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻。沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻。4 4 ，將磨碎液分倒入將磨碎液分倒入1.5 ml1.5 ml的滅菌離心管的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二；中，磨碎液的高度約占管的三分之二；5 5，置于置于6565的水浴槽或恒溫箱中，每隔的水浴槽或恒溫箱中，每隔10 min10 min輕輕搖動(dòng)，輕輕搖動(dòng)，3060min3060min后取出；后取出； 6 6，冷卻冷卻2 min2 min后，加入氯仿后，加入氯仿- -異戊醇（異戊醇（2424：1 1）至滿管，至滿管，充分混勻充分混勻23 min23 min7 7，放入離心機(jī)中放入離心機(jī)中1000010000 r

7、pmrpm離心離心10 min10 min，與此，與此同時(shí)，將同時(shí)，將600 ul600 ul的異丙醇加入另一新的滅菌離心的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；管中； 8 8， 10000 rpm 10000 rpm離心離心1 min1 min后，移液器輕輕地吸后，移液器輕輕地吸取上清取上清液液，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)管慢慢上下?lián)u動(dòng)30 s30 s，使異丙醇與水層充分混合，使異丙醇與水層充分混合至能見(jiàn)到至能見(jiàn)到DNADNA絮狀物；絮狀物；9 9，10000 rpm10000 rpm離心離心1 min1 min后，立即倒掉液體，注意勿將后，立

8、即倒掉液體，注意勿將白色白色DNADNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開(kāi)的紙巾上；沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開(kāi)的紙巾上； 1010, , 60 s60 s后，直立離心管，加入后，直立離心管，加入720ul720ul的的75%75%乙醇及乙醇及80 80 ul 5 Mul 5 M的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，用手指彈管尖，使沉淀與管的醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，用手指彈管尖，使沉淀與管底的底的DNADNA塊狀物浮游于液體中；塊狀物浮游于液體中； 1111，放置放置30 min30 min，使，使DNADNA塊狀物的不純物溶解；塊狀物的不純物溶解； 1212，10000 rpm10000 rpm離心離心1 min1 mi

9、n后，倒掉液體，再加入后，倒掉液體，再加入800 800 ul 75%ul 75%的乙醇，將的乙醇，將DNADNA再洗再洗 30 min 30 min； 1313，10000 rpm10000 rpm離心離心30 s30 s后，立即倒掉液體，將離心管后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開(kāi)的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥倒立于鋪開(kāi)的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNADNA（自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干）；（自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干）； 1414，加入加入50 ul 0.5 50 ul 0.5 TE( TE(含含RNase)RNase)緩沖液，使緩沖液，使DNADNA溶溶解，置于解，置于3737恒溫箱

10、約恒溫箱約15 h15 h，使，使RNARNA消解消解 紫外光照射法：紫外光照射法： 1 1配制染色劑。用蒸餾水配制萬(wàn)分之五配制染色劑。用蒸餾水配制萬(wàn)分之五的溴化乙錠（的溴化乙錠（EBEB）溶液。）溶液。 2 2將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上，再滴一滴紙上，再滴一滴EBEB溶液染色。溶液染色。 3 3將蠟紙放在紫外燈（將蠟紙放在紫外燈（260 nm260 nm）下照射）下照射（暗室中），可見(jiàn)橙紅色的螢光（暗室中），可見(jiàn)橙紅色的螢光（DNADNA的的紫外吸收高峰在紫外吸收高峰在280 nm280 nm處）。處）。 1，在在DNADNA提取、制備的過(guò)程中，核酸

11、極不穩(wěn)提取、制備的過(guò)程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)： 化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pHpH值值4.011.04.011.0間較穩(wěn)定，間較穩(wěn)定，pHpH值在此范圍外就會(huì)使核酸變性值在此范圍外就會(huì)使核酸變性降解，故制備過(guò)程應(yīng)避免過(guò)酸過(guò)堿。降解，故制備過(guò)程應(yīng)避免過(guò)酸過(guò)堿。 物理因素，物理因素，DNADNA分子鏈很長(zhǎng)，是雙螺旋結(jié)分子鏈很長(zhǎng)，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性。又有一定的剛性，故構(gòu)，既有一定的柔性。又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會(huì)令強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會(huì)令DNADNA分子斷裂，分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。不利于收集，應(yīng)加

12、以避免。酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來(lái)，在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來(lái)，它會(huì)降解它會(huì)降解DNADNA分子。故須用酶的變性劑、分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過(guò)程最好在低抑制劑使之失活。操作過(guò)程最好在低溫溫(0(0左右左右) )下進(jìn)行。下進(jìn)行。 ,2 2，所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。 1.1.用酚抽提細(xì)胞用酚抽提細(xì)胞DNADNA時(shí)，有什么作用？時(shí)，有什么作用？ 使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNaseDNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)的降解作用。用苯酚處理勻

13、漿液時(shí), ,由于蛋白與由于蛋白與DNA DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷聯(lián)結(jié)鍵已斷, ,蛋白分蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNADNA溶于水相。溶于水相。 2.2.氯仿的作用？氯仿的作用？ 克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層?？朔拥娜秉c(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。 最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的跡量最后用氯仿抽提，去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）酚。（酚易溶于氯仿中）3.3.異戊醇的作用？異戊醇的作用？ 減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使