食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)培訓(xùn)

1、食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)培訓(xùn)（GB/T4789.2）2022-4-261內(nèi)容一、立項(xiàng)修訂依據(jù)二、主要修訂內(nèi)容三、檢驗(yàn)程序四、第一法五、第二法 2022-4-263一 立項(xiàng)修訂依據(jù)修訂的背景 標(biāo)準(zhǔn)清理 多年未進(jìn)行修訂修訂的意義（緊迫性） WTO的要求 原標(biāo)準(zhǔn)的局限（培養(yǎng)基、計(jì)數(shù)方式等） 3M紙片法菌落總數(shù)的衛(wèi)生學(xué)意義2022-4-264修訂依據(jù)（修訂的主要參考方法） FDA/BAM Chapter 3 Aerobic Plate Count Jan. 2001SN 0168-92 出口食品平板菌落計(jì)數(shù)AOAC 986.32Aerobic Plate Count in FoodsAOAC 988

2、.18Aerobic Plate CountAOAC 990.12Aerobic Plate Count in FoodsUSDA/FSIS MLG CHAPTER 3 EXAMINATION OF FRESH, REFRIGERATED AND FROZEN PREPARED MEAT, POULTRY AND PASTEURIZED EGG PRODUCTS ISO 4833:1991 Microbiology - General guidance for the enumeration of micro-organisms - Colony count technique at 30 d

3、egrees C ISO 6610:1992 Milk and milk products-Enumeration Colony-forming units of micro-organisms-Colony-count technique at 30NMKL APHA CCFRA JAPAN HPB2022-4-265 二、修訂的主要內(nèi)容培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)瓊脂改為平板計(jì)數(shù)瓊脂添加了PetrifilmTM 細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)測(cè)試片法菌落計(jì)數(shù)公式進(jìn)行了修改添加了拍打式均質(zhì)器或等效的設(shè)備 2022-4-2661、培養(yǎng)基改變情況平板計(jì)數(shù)瓊脂平板計(jì)數(shù)瓊脂 （PCA)胰蛋白胨 5.0g酵母浸膏 2.5g葡萄糖 1.

4、0g瓊脂 15.0g蒸餾水 1000mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂（營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA)蛋白胨 10.0g牛肉膏3.0g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g蒸餾水 1000mL2022-4-267培養(yǎng)基改變依據(jù) 國(guó)外食品微生物權(quán)威的檢測(cè)方法如ISO、AOAC和FDA/BAM等基本上都是采用平板計(jì)數(shù)瓊脂或在平板計(jì)數(shù)瓊脂的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良； 針對(duì)能力驗(yàn)證菌落總數(shù)的樣品，采用兩種培養(yǎng)基，結(jié)果無(wú)顯著性差異； 平板計(jì)數(shù)瓊脂具有細(xì)菌比較容易生長(zhǎng)，菌落特征明顯，容易計(jì)數(shù)等特點(diǎn)。2022-4-2682、3MTM PetrifilmTM 細(xì)菌總數(shù)試片法 國(guó)外情況 比對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)（已發(fā)表） 標(biāo)準(zhǔn)方法 國(guó)內(nèi)情況 使用狀況 比對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)（已發(fā)表）2

5、022-4-269優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1、培養(yǎng)基具有良好的生產(chǎn)質(zhì)量；2、菌落計(jì)數(shù)特別方便（容易判讀），紅色菌落，易于食品顆粒分開，也不菌落重疊現(xiàn)象；3、準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，有方格，尤其是數(shù)目較多時(shí)，兩個(gè)人分別計(jì)數(shù)同一紙片時(shí)差異；4、菌落分布特別均勻；5、平行平板菌落結(jié)果一致性比較好，與避免了熱損傷有關(guān)；6、菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生；7、安全方面不像玻璃平皿易碎、對(duì)人員造成潛在的傷害，另外密封比較好，不容易直接接觸菌落。缺點(diǎn)：1、某些有紅色顆粒的樣品，需要注意；粘稠的液體樣品，不易分散開；表面活性比較大，易流出等2、顏色特別重的樣品，如桔黃色，掩蓋了菌落；3、抑菌劑濃度比較高的樣品，如辣椒及辣椒粉、大蒜及

6、洋蔥制品；4、某些微生物會(huì)液化凝膠，造成局部擴(kuò)散或菌落模糊的現(xiàn)象，大部分是芽胞桿菌。3、菌落計(jì)算公式有兩個(gè)稀釋度的菌落數(shù)在合適范圍，按照如下公式計(jì)算：N = 樣品中菌落數(shù)C =平板菌落數(shù)之和n1 = 含合適范圍菌落數(shù)的第一稀釋度（低）平板數(shù)n2 =含合適范圍菌落數(shù)的第二稀釋度（高）平板數(shù)d = 第一稀釋度（低）2022-4-2611dnnCN)1.0(21菌落計(jì)算公式1:100（第一稀釋度） 232，2441:1000（第二稀釋度）33，35dnnCN)1 . 0(212022-4-26122500024727102 . 254410)21 . 0(2353324423222菌落計(jì)算例子300

7、0030150104120610435038024423221022212211222111dnCnCdnCdnCN1:100（第一稀釋度） 232，2441:1000（第二稀釋度）38，352022-4-26132500024909102 . 254910)21 . 0 (2 3538244232)1 . 0(2221dnnCN統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)： 平板菌落數(shù)越多，結(jié)果越具有代表性；平板菌落數(shù)越多，結(jié)果越具有代表性； （不考慮稀釋倍數(shù)和培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況等） 取樣量越大，結(jié)果越具有代表性；取樣量越大，結(jié)果越具有代表性； （同等取樣條件、排除其他方面的干擾因素） 兩個(gè)相鄰的稀釋度平板菌落數(shù)直接

8、相加，不考慮稀釋倍數(shù)的影響，采用加權(quán)平均值代替簡(jiǎn)單的算術(shù)平均值2022-4-26144、其他內(nèi)容菌落形成單位的定義菌落總數(shù)的英文培養(yǎng)溫度和時(shí)間 361培養(yǎng)48h2h。水產(chǎn)品301培養(yǎng)72h3h微量移液器天平2022-4-2615三 檢驗(yàn)程序2022-4-2616 361 48h2h檢 樣 25g(mL)樣品+ 225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇23個(gè)適宜樣品勻液，各取1mL分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)培 養(yǎng)計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)計(jì)算菌落總數(shù)每皿中加入15mL20mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻報(bào) 告第一法 平板菌落計(jì)數(shù)法操作步驟樣品稀釋 固體和半固體樣品：固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225 mL

9、磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000 r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225 mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。 液體樣品：液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。操作步驟樣品稀釋 用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的

10、樣品勻液。 按上述操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無(wú)菌吸管或吸頭。操作步驟樣品稀釋 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1mL稀釋液加入2個(gè)無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。 及時(shí)將15mL20mL冷卻至46的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于461恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。操作步驟培養(yǎng) 瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，361培養(yǎng)48h2h。水產(chǎn)品301培養(yǎng)72h3h。 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的

11、瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按上述條件進(jìn)行培養(yǎng)。菌落計(jì)數(shù) 可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，cfu）表示。 選取菌落數(shù)在30cfu300cfu之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30cfu的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300cfu的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后

12、乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。 平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)(菌落之間無(wú)明顯界線)，則應(yīng)將每條鏈（不同來(lái)源）作為一個(gè)菌落計(jì)。結(jié)果的表述菌落總數(shù)的計(jì)算方法若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式計(jì)算。 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均

13、無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。結(jié)果的表述菌落總數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。 大于或等于100時(shí)，前第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來(lái)表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，此時(shí)也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。 若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。 若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。 稱重取樣以cfu/g為單位報(bào)告，體積取樣以cfu/

14、mL為單位報(bào)告。第二法 菌落總數(shù)PetrifilmTM測(cè)試片法檢驗(yàn)程序 除將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基改成PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片外，其它與檢驗(yàn)程序同第一法。操作步驟樣品的稀釋 1:10的樣品勻液制備后，用1mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至6.67.2。 其他步驟同第一法操作步驟接種 根據(jù)對(duì)樣本污染狀況的估計(jì)，選擇23個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液進(jìn)行檢驗(yàn)。將測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面，揭開上層膜，用吸管或微量移液器吸取1mL樣品勻液，垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜蓋下，允許上層膜直接落下，但不要滾動(dòng)上層膜，將壓板（凹面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)膜上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1分鐘以使培養(yǎng)基凝固。每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。操作步驟培養(yǎng) 將測(cè)試片的透明面朝上，水平置于培養(yǎng)箱內(nèi)。可堆疊至20片，培養(yǎng)溫度和時(shí)間同第一法。操作步驟計(jì)數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后立即計(jì)數(shù),可肉眼觀察計(jì)數(shù)，或用菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡、PetrifilmTM自動(dòng)判