生物檢測技術(shù)——核酸探針

1、生物檢測技術(shù)生物檢測技術(shù) 核酸探針核酸探針 前言前言 從基因工程技術(shù)一開始，就伴隨著核酸探針的應(yīng)用。在許多領(lǐng)域如基因研究、SNP檢測、STR檢測、腫瘤研究、藥理學(xué)研究等方面，核酸探針都是一種強有力的工具。為了能更好的應(yīng)用和發(fā)展核酸探針，有必要對核酸探針有一個系統(tǒng)的認識。 核酸探針是以研究和診斷為目的，用來檢測特定序列核酸(DNA 或RNA)的DNA或RNA片段，稱為核酸探針，作為探針的核酸探針片段可以較短(20 bp)，也可以較(5kb)。 核酸探針具有特定的序列，能夠與具有相應(yīng)核苷酸堿基互補序列的核酸片段結(jié)合，因此可用于樣品中特定基因片段的檢測。核酸探針的標(biāo)記物核酸探針的標(biāo)記物一一.放射性標(biāo)

2、記放射性標(biāo)記 放射性同位素是最早使用、也是目前應(yīng)用最廣泛的探針標(biāo)記物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中，以32P應(yīng)用最普遍。 放射性標(biāo)記的優(yōu)點是靈敏度高，可以檢測到pg級；缺點是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、不穩(wěn)定、成本高。因此，放射性標(biāo)記的探針不能實現(xiàn)商品化。目前，許多實驗室都致力于研究非放射性標(biāo)記的探針。二二.非放射性標(biāo)記非放射性標(biāo)記 目前應(yīng)用較多的非放射性標(biāo)記物是生物素和地高辛，二者都是半抗原。 生物素是一種小分子水溶性維生素，對親和素有獨特的親和力，兩者能形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進行檢測。 地高辛是一種類固醇半抗原

3、分子，可利用其抗體進行免疫檢測，運用原理類似于生物素的檢測。地高辛標(biāo)記核酸探針的檢測靈敏度可與放射性同位素標(biāo)記的相當(dāng)，而特異性優(yōu)于生物素標(biāo)記，其應(yīng)用日趨廣泛。核酸探針檢測的原理核酸探針檢測的原理 核酸探針檢測所依據(jù)的是核酸分子雜交，其工作原理是堿基配對，即2條堿基互補的DNA鏈(或2條堿基互補的DNA鏈和RNA鏈)在適當(dāng)條件下可以按堿基配對原則，形成雜交DNA分子。 生物體含有相對穩(wěn)定的DNA序列，不易受外界環(huán)境因素的影響而改變。一般來說同種生物的DNA序列相同，不同種生物體DNA序列不同生物個體都有自己獨特的DNA序列。根據(jù)中心法則DNA雙鏈的核苷酸分子是通過堿基之間的氫鍵作用力專一性互補配

4、對而結(jié)合在一起的，每個基因的RNA和對應(yīng)的模板DNA鏈也可以通過堿基配對而結(jié)合在一起。核酸探針就是根據(jù)核酸分子之間的互補配對原則設(shè)計的一種檢測目標(biāo)DNA序列是否存在的一段核酸序列。核酸探針的分類及制備方法核酸探針的分類及制備方法 根據(jù)核酸的來源和性質(zhì)，核酸探針可分為RNA探針、人工合成的寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針等幾類。1） RNA探針探針 RNA探針一般都是單鏈，它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點，又具有許多DNA單鏈探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點，主要是：RNA：DNA雜交體比DNA：DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性，所以在雜交反應(yīng)中RNA探針比相同活性的DNA探針?biāo)a(chǎn)生信號要強。RNA：RNA雜交

5、體用RNA酶A(胰RNA酶)切比用Sl酶切DNA：RNA雜交體容易控制，所以用RNA探針進行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果好。 RNA的探針制備過程是將一段含完整或部分基因的DNA片段插入重組質(zhì)粒的多克隆位點，以內(nèi)切酶在插入片段中某一適當(dāng)部位或插入片段下游的某一部位消化重組質(zhì)粒，使之成為線性DNA，然后在相應(yīng)的DNA依賴RNA聚合酶催化下，以含有目的基因的DNA片段為模板合成RNA探針。2)人工合成的寡核苷酸探針人工合成的寡核苷酸探針 人工合成的寡核苷酸探針是在已知基因序列的情況下。由核酸合成儀來完成，可廉價獲得大量的此類探針，長度一般長約1030bp，甚至可達50 bp。如果已知核酸序列可

6、根據(jù)已知DNA或RNA序列合成精確互補的DNA探針，單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準確配對，可以準確地設(shè)計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交，對于一些未知序列的目的片段則無效；如果不知道核酸序列，可依據(jù)其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸順序推導(dǎo)出核酸序列從而合成DNA探針。3)單鏈單鏈DNA探針和雙鏈探針和雙鏈DNA探針探針 用雙鏈探針雜交驗測另一個遠緣DNA時，探針序列與被檢測序列之間有很多錯配，但是，2條探針互補鏈之間的配對卻十分穩(wěn)定，即形成自身的無效雜交，結(jié)果使檢測效率下降?？茖W(xué)上采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法:(1)從Ml3載體

7、衍生序列合成單鏈DNA探針。(2)以RNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。 雙鏈DNA探針的合成方法：切口平移法和隨機引物合成法。雙鏈DNA探針在與靶序列雜交前，DNA分子必須變?yōu)閱捂?，這一般是通過加熱使其變性而達到解鏈目的。解鏈DNA分子被迅速冷卻到只能緩慢復(fù)性的溫度以下，可使探針保持單鏈狀態(tài)。核酸探針的應(yīng)用現(xiàn)狀核酸探針的應(yīng)用現(xiàn)狀一一 食品檢測中的應(yīng)用食品檢測中的應(yīng)用：核酸探針技術(shù)已被用于檢驗核酸探針技術(shù)已被用于檢驗食品中食品中 一些常見的病原菌。一些常見的病原菌。 （1）大腸桿菌： 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)是引起人和動物腹瀉的主要病原之一。用生物素標(biāo)記的編碼大腸桿菌耐熱腸毒素(

8、ST)的DNA 片段作為基因探針，檢測了污染食品(包括鮮豬肉、雞蛋、牛乳)中的產(chǎn)ST 大腸桿菌。 （2）沙門氏菌：沙門氏菌是重要的人畜共患致病菌及食物中毒性細菌之一，廣泛地分布于自然界及畜禽體內(nèi)。由該菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的首位。利用生物素標(biāo)記的克隆沙門氏菌DNA 片段作為基因探針，檢測了臨床樣品、食品及飼料樣品中的沙門氏菌。二二 DNA測序及再測序中的應(yīng)用測序及再測序中的應(yīng)用 DNA 測序早期采用Maxam 和Gilbert的化學(xué)法與Sanger的雙脫氧法進行測序。由于這兩種測序方法是手工測序，所以它的精確度較低。在以上兩種方法的基礎(chǔ)上，通過與計算機技術(shù)和熒光技術(shù)的結(jié)合，產(chǎn)生的自動

9、測序儀在很大程度上提高測序的精確度。近幾年，由于DNA測序技術(shù)的不斷發(fā)展和測序策略的日益成熟，以及自動測序儀的改進，序列測定速度和準確率大為提高，隨之出現(xiàn)了基因芯片的測序，它是利用固定探針的樣品，進行分子雜交產(chǎn)生的雜交圖譜，而排列出待測樣品的序列。 隨之就出現(xiàn)了基因芯片雜交測序技術(shù)(SBH)和鄰位雜交測序技術(shù)(GSH)。 基因芯片基因芯片 原理原理 原型原型三三 檢測人及生物體基因組中特異性序列檢測人及生物體基因組中特異性序列 用非放射性核酸探針 地高辛核酸探針可對醫(yī)學(xué)病毒，禽類病毒，植物病毒的進行檢測；用重復(fù)DNA 片段來檢測麻風(fēng)桿菌；用rRNA探針檢測銅綠假單脆菌；用核酸探針檢測腺病毒、B

10、K病毒，巨細胞病毒以及惡性病原蟲、弓形蟲、利氏曼原蟲等。 雖然以上核酸探針已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各類病毒的檢測，但在檢測技術(shù)方面還有一些問題，檢測一種菌就需要制備一種探針一次只能檢測出一種菌或病毒檢測的操步驟復(fù)雜，效率低等缺點。而基因芯片可將大量的探針同時固定于支持物上，所以一次可對大量核酸分子進行檢測分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交的操作復(fù)雜，自動化程度低，檢測目的分子數(shù)量少，效率低的缺陷，使核酸探針的應(yīng)用更加廣闊 ?，F(xiàn)在基因芯片可以用于檢測人類的許多疾病如腫瘤，血友病，地中海貧血病，異常血紅蛋白病，苯酮尿病等。四四 臨床診斷和司法方面的應(yīng)用臨床診斷和司法方面的應(yīng)用 目前利用核酸探針發(fā)展起來的PC

11、R在臨床上的應(yīng)用廣泛，。例如：對結(jié)核、麻風(fēng)、沙眼衣原體、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌等微生物病原體的檢測；對艾滋病、病毒、細胞淋巴瘤病毒的檢測；數(shù)十種遺傳病(如鐮刀狀細胞貧血、血友病、肌營養(yǎng)不良癥、舞蹈癥等)都采用PCR診斷；腫瘤的診斷；性別鑒定；DNA指紋鑒定。 診斷芯心技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和PCR擴增技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)?，F(xiàn)在，肝炎病毒檢測診斷芯片 、結(jié)核桿菌耐的性檢測芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開始進入市場。未來人們在體檢時，由搭載基因芯片的診斷器機器人，對受檢者取血，轉(zhuǎn)瞬間體驗結(jié)果便可以顯示在計算機的屏幕上。五五 核酸探針技術(shù)在浮游

12、植物檢測中的應(yīng)用核酸探針技術(shù)在浮游植物檢測中的應(yīng)用 核酸探針技術(shù)在浮游植物檢測中的應(yīng)用的是利用高特異性的寡核苷酸探針直接與細胞內(nèi)的或從細胞中提取出來的rRNA進行雜交，從而在混合樣品中檢測到特定物種的存在。 不同物種的基因序列在某些位點會存在一定幾率的突變，但是它們本身又具有高度的保守性，其序列的相似程度可以反映出它們在系統(tǒng)發(fā)育上的關(guān)系，當(dāng)其全序列或者大部分序列被分析時，就可以得到有關(guān)物種在系統(tǒng)發(fā)育方面的足夠信息并因此知道它們在系統(tǒng)發(fā)育上的位置，從而鑒定浮游植物。而利用基于這些信息而設(shè)計的寡核苷酸探針即可以直接在環(huán)境樣品進行原位雜交，或者與細胞裂解物進行三明治夾心雜交，從而檢測到特定浮游植物在特定海區(qū)的存在與否。核酸探針的前景核酸探針的前景 基因芯片在環(huán)保方面、食品檢測方面的研究報道比較少，這將成為將來的研究方向。從某種意義上我們可以認為：基因結(jié)構(gòu)或種類決定物種，基因功能或表達則決定生命即生物的生、老、病、死?；蛐酒夹g(shù)將為我們提供一條認識生命本質(zhì)的捷徑，同時它的發(fā)展也帶動了