全血膽堿脂酶測(cè)定

1、全血膽堿酯酶活性的測(cè)定全血膽堿酯酶活性的測(cè)定三氯化鐵比色法三氯化鐵比色法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆杖莆杖狢hE活性測(cè)定的意義活性測(cè)定的意義掌握全血掌握全血ChE活性測(cè)定原理、方法活性測(cè)定原理、方法方方 法法Asch-DTNB比色法（比色法（GBZ52）三氯化鐵比色法三氯化鐵比色法溴麝香草酚藍(lán)（溴麝香草酚藍(lán)（BTB）比色法）比色法紙片法紙片法Biocheck法（便攜式分析儀）法（便攜式分析儀）三氯化鐵比色法三氯化鐵比色法原理原理乙酰膽堿乙酰膽堿膽堿酯酶膽堿酯酶膽堿膽堿+ +乙酸乙酸堿性羥胺堿性羥胺乙酰羥胺乙酰羥胺HClHClFeClFeCl3 3羥肟酸鐵羥肟酸鐵( (棕紅色絡(luò)合物棕紅色絡(luò)合物)

2、)三氯化鐵比色法三氯化鐵比色法原理原理血液中膽堿酯酶可使乙酰膽堿水解生成膽堿和乙酸，終止反應(yīng)后，剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺作用生成乙酰羥胺，然后在酸性環(huán)境中與三氯化鐵反應(yīng)生成棕紅色羥肟酸鐵絡(luò)合物。其顏色深淺與乙酰膽堿的量成正比，在520nm進(jìn)行比色定量，從而推算出膽堿脂酶活性。 實(shí)驗(yàn)器材一次性注射器一次性注射器(1ml) 12個(gè)，采血用；個(gè)，采血用；微量移液器（微量移液器（20l）；分光光度計(jì)；）；分光光度計(jì)；玻璃比色杯玻璃比色杯(每組至少每組至少3個(gè)個(gè))；擦鏡紙；擦鏡紙；恒溫水浴箱（恒溫水浴箱（370.5 ）移液管移液管(0.2ml，1ml，5ml)；試管；漏斗；容量瓶試管；漏斗；容量瓶 試劑

3、試劑均為分析純，水為蒸鎦水或去離子水。試劑均為分析純，水為蒸鎦水或去離子水。 1磷酸鹽緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.2 準(zhǔn)確稱(chēng)取磷準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸氫二鈉酸氫二鈉(Na2HP0412H2O)16.72g和磷酸二氫鉀和磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.72g，用水溶解并稀釋到，用水溶解并稀釋到1000ml，置置4冰箱中保存。冰箱中保存。 2堿性羥胺溶液堿性羥胺溶液 臨用時(shí)將臨用時(shí)將139 g/L的鹽酸的鹽酸羥胺溶液與羥胺溶液與140 g/L的氫氧化鈉溶液等體積混的氫氧化鈉溶液等體積混合。合。 3鹽酸溶液鹽酸溶液1+2 濃鹽酸濃鹽酸l份加水份加水2份混合。份混合。 試劑 4三氯化鐵溶液三氯化鐵溶液 (

4、100 g/L) 稱(chēng)取稱(chēng)取10g三氯化三氯化鐵鐵(FeCl36 H2O )，加濃鹽酸，加濃鹽酸0.84ml，溶解后再，溶解后再加水至加水至100ml，貯存于棕色瓶中。，貯存于棕色瓶中。 5氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1)標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精確稱(chēng)取氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精確稱(chēng)取氯化乙酰膽堿1.2716g，用，用pH=7.2的磷酸鹽緩沖液溶解并稀的磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至釋至100ml。此溶液。此溶液1ml含含70 mol乙酰膽堿。乙酰膽堿。置置4冰箱內(nèi)保存。冰箱內(nèi)保存。 (2)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：取標(biāo)準(zhǔn)貯備液用磷酸鹽緩標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：取標(biāo)準(zhǔn)貯備液用磷酸鹽緩沖液稀釋沖液稀釋10倍。此液倍。此液1m

5、l含含7 mol乙酰膽堿，乙酰膽堿，于臨用前配制。于臨用前配制。分析步驟分析步驟1. 乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 2. 樣品測(cè)定樣品測(cè)定1.乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）取六只）取六只具塞具塞試管，配制不同濃度的乙酰膽堿溶液試管，配制不同濃度的乙酰膽堿溶液管號(hào)管號(hào)123456乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（用液（ml）00.20.40.60.81.0磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液（ml）21.81.61.41.21.0乙酰膽堿含量乙酰膽堿含量（mol）01.42.84.25.67.0（2）各管加堿性羥胺）各管加堿性羥胺4ml，立即振搖，立即振搖2 min（3）

6、各管加）各管加1 2鹽酸溶液鹽酸溶液2ml，振搖，振搖2 min（4）各管加）各管加10%三氯化鐵溶液三氯化鐵溶液2ml，搖勻，過(guò)濾，搖勻，過(guò)濾（5）測(cè)吸光度）測(cè)吸光度:=520nm，參比管，參比管-第第1管管（6）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線2.樣品測(cè)定樣品測(cè)定A管（樣品管）管（樣品管）B管（對(duì)照管）管（對(duì)照管）0.98ml 磷酸緩沖液磷酸緩沖液0.98ml 磷酸緩沖液磷酸緩沖液20 l 血血20 l 血血37水浴水浴 5min堿性羥胺堿性羥胺4ml, 振振3min乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液1ml乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液1ml37水浴水浴 30min（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)

7、）堿性羥胺堿性羥胺4ml,振振3min 1 2鹽酸溶液鹽酸溶液2ml, 搖搖1min 10%三氯化鐵溶液三氯化鐵溶液2ml 搖勻、過(guò)濾、比色搖勻、過(guò)濾、比色計(jì)計(jì) 算算1.被水解被水解 的乙酰膽堿吸光度的乙酰膽堿吸光度= 對(duì)照管吸光度（對(duì)照管吸光度（B管）管） 樣品管吸光度（樣品管吸光度（A管）管）2.對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出被水解的乙酰膽堿對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出被水解的乙酰膽堿( mol ) -即即0.02ml血經(jīng)血經(jīng)37 ，30min反應(yīng)條件下的反應(yīng)條件下的 膽堿酯酶膽堿酯酶活性絕對(duì)值活性絕對(duì)值C C3.膽堿酯酶膽堿酯酶活性相對(duì)值（活性相對(duì)值（% %）浙江地區(qū)健康人浙江地區(qū)健康人膽堿酯酶活性絕對(duì)值膽堿酯酶活性絕對(duì)值男：男：3.22 3.22 0.336 0.336 mol 女：女：3.19 3.19 0.398 0.398 mol 100值健康人堿酯酶活性絕對(duì)值樣品膽堿酯酶活性絕對(duì)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)采血前先準(zhǔn)備好試管，加入采血前先準(zhǔn)備好試管，加入磷緩磷緩采血時(shí)嚴(yán)格采血時(shí)嚴(yán)格消毒消毒，用過(guò)的棉球、刺針集，用過(guò)的棉球、刺針集中放置中放置準(zhǔn)確控制水浴準(zhǔn)確控制水浴溫