臨床檢驗(yàn)技師-寄生蟲學(xué)及檢驗(yàn)2019講義試驗(yàn)檢驗(yàn)技術(shù)

1、第五章實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)技術(shù)一、病原檢查1.糞便檢查(1)直接涂片法：適用于蠕蟲卵、原蟲檢查(活滋養(yǎng)體檢查和包囊的碘液檢查)。(2)濃集法1)加藤厚涂片法。2)沉淀法：自然沉淀法主要用于蠕蟲的檢查、離心沉淀法、倒置沉淀法適于比重較大的蠕蟲卵檢查、汞碘醛離心沉淀法適于原蟲滋養(yǎng)體、包囊、蠕蟲卵和幼蟲的檢查；醛醒沉淀法適于蠕蟲卵和原蟲包囊的檢查。3)漂浮法：飽和鹽水漂浮法適于各種線蟲卵、帶絳蟲卵等檢查；硫酸鋅離心漂浮法適于原蟲包囊、多數(shù)蠕蟲卵等檢查；蔗糖溶液漂浮法適于原蟲包囊、卵囊或抱子囊檢查。4)尼龍袋集卵法：主要適于血吸蟲卵檢查。(3)蟲卵計(jì)數(shù)法1)改良加藤厚涂片法：適于各種蠕蟲卵計(jì)數(shù)。2)小管浮聚計(jì)數(shù)法

2、：適于大多線蟲卵計(jì)數(shù)。(4)毛孵化法：適于血吸蟲病原體檢查。(5)鉤蝴培養(yǎng)法：檢出率較直接涂片法高7倍。(6)帶絳蟲孕節(jié)檢查法：肉眼可觀察。(7)常用原蟲檢查染色法：勞氏酸性品紅-固綠染色法適于阿米巴、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲檢查、福氏快速蘇木精染色法適于阿米巴、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊檢查、金月$-酚染色法和改良抗酸染色法適于隱抱子蟲卵囊檢查。2 .肛門外檢查(1)肛門周圍蟒蟲蟲卵檢查：有透明膠紙法、棉簽拭子法，適于蟒蟲、帶絳蟲檢查。(2)肛門周圍蟒蟲成蟲檢查：在肛門附近發(fā)現(xiàn)白色小蟲，可進(jìn)一步鑒定。肛門周圍蟒蟲蟲卵及成蟲檢查3 .血液及骨髓檢查(1)檢查微絲蝴：新鮮血片檢查法；厚血膜法；活微絲蝴濃集

3、法；離心濃集法。第1頁共6頁(2)檢查瘧原蟲：新鮮血片檢查法：采血、制片(薄血膜，厚血膜)、固定、染色；定量血沉棕黃色層(QBC檢查法；瘧原蟲計(jì)數(shù)法。4 .其他排泄物與分泌物檢查(1)痰液檢查：適于肺吸蟲卵、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體、蛔蝴等檢查，方法有：直接涂片法、消化沉淀法。(2)尿液和鞘膜積液檢查：適于檢查班氏微絲螃，可用離心法。(3)陰道分泌物檢查：適于檢查陰道毛滴蟲等，可用直接涂片法、懸滴法、涂片染色法。檢查陰道毛滴蟲(4)前列腺液檢查：適于檢查男性泌尿生殖道的陰道毛滴蟲。(5)十二指腸液檢查：十二指腸液檢查引流液檢查適于糞便檢查寄生蟲陰性時(shí)使用；腸檢膠囊法適于藍(lán)氏賈第鞭毛蟲。(6)腦脊液

4、檢查：適于弓形蟲、溶組織阿米巴大滋養(yǎng)體和肺吸蟲卵等檢查。(7)漿膜腔積液檢查：適于檢查弓形蟲、微絲蝴等。5 .活組織檢查(1)皮膚及皮下結(jié)節(jié)活檢：適于檢查利什曼原蟲、蠕蟲、疥蛾和蠕形蛾；肌肉活檢：適于檢查旋毛蟲幼蟲、豬囊蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲等其他蠕蟲；(3)淋巴結(jié)活檢：適于檢查利什曼原蟲、弓形蟲和絲蟲成蟲；(4)腸黏膜活檢：適于檢查日本血吸蟲卵、溶組織內(nèi)阿米巴。肌肉活檢：適于檢查旋毛蟲幼蟲第2頁共6頁6 .人工培養(yǎng)與動物接種當(dāng)被檢者疑為寄生蟲病而直接病原體檢查陰性時(shí)，可做人工培養(yǎng)與動物接種。常用的有：溶組織內(nèi)阿米巴培養(yǎng)；致病性自生生活阿米巴培養(yǎng)；杜氏利什曼原蟲培養(yǎng)；弓形體接種；陰道毛滴蟲培養(yǎng)；

5、旋毛蟲接種；杜氏利什曼原蟲接種。二、免疫學(xué)檢查寄生蟲病的免疫診斷，主要是應(yīng)用免疫學(xué)方法檢查患者血液循環(huán)中或體液中針對寄生蟲的抗體或由寄生蟲本身分泌排泄的抗原，方法大多較為敏感，可以檢出微量存在的抗體或抗原，因之，對臨床上疑似的患者，可提供診斷依據(jù)，有重要的輔助診斷價(jià)值；在寄生蟲病防治工作中，可進(jìn)一步查清病人，監(jiān)測疫情變化并評價(jià)防治工作效果。寄生蟲病免疫診斷的價(jià)值，主要根據(jù)以下幾個指標(biāo)：所用的方法需有足夠的敏感性，能查出絕大多數(shù)的病人；有較好的特異性，對其他寄生蟲病很少發(fā)生交叉反應(yīng)，健康人無假陽性；能用于療效考核，病人經(jīng)有效治療后陰轉(zhuǎn)較快；能反映病情，可以定量；方法簡便易行、經(jīng)濟(jì)，可以在基層推廣

6、。寄生蟲病的免疫診斷，主要是應(yīng)用已知的抗原檢測患者血液中或其他體液中相應(yīng)的抗體。有些蟲種，如血吸蟲病、瘧疾、絲蟲病、華支睪吸蟲病，并殖吸蟲病和豬囊蟲病等的診斷中已應(yīng)用特異的多克隆抗體或單克隆抗體(McAtO進(jìn)行循環(huán)抗原的檢測研究，并成功地試用于現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查。免疫診斷用的抗原，可以是寄生蟲生活史中的任何一個階段，例如血吸蟲的蟲卵，毛螃、尾蝸以及成蟲均可用作診斷抗原。診斷用的抗原，可以是整蟲，蟲體的石蠟切片或冷凍切片，有不少方法是應(yīng)用寄生蟲的不同發(fā)育階段的組織勻漿或提取物一一可溶性抗原，也有使用寄生蟲的排泄分泌物作為抗原(代謝抗原)。例如血吸蟲病診斷用的環(huán)卵沉淀試驗(yàn)和尾蝴膜試驗(yàn)是采用完整的蟲卵

7、及尾螃；間接免疫熒光試驗(yàn)，既可用整蟲，也可用蟲體的切片；而在皮內(nèi)試驗(yàn)、免疫電泳、對流免疫電泳、間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法中所用的則都是寄生蟲的可溶性抗原。應(yīng)用于寄生蟲病診斷的免疫學(xué)檢查方法，簡單介紹如下：1 .皮內(nèi)試驗(yàn)(ID)(1)原理：寄生蟲變應(yīng)原刺激宿主后，機(jī)體產(chǎn)生親細(xì)胞性的IgE抗體和IgG4抗體當(dāng)同樣抗原與抗體結(jié)合后，可引起肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放活性介質(zhì)，使注射部位局部出現(xiàn)紅腫。(2)應(yīng)用：ID多用于蠕蟲病的診斷及某些蛾蟲所致的變態(tài)反應(yīng)的診斷?？捎糜诙喾N寄生蟲病的檢測，如血吸蟲病、肺吸蟲病、肝吸蟲病、囊蟲病、棘球蜘病、絲蟲病、幼蟲移行癥等。皮內(nèi)試驗(yàn)可用作：過篩方法

8、，先作皮試，陽性者再作進(jìn)一步檢查；臨床輔助診斷；考核預(yù)防效果，用作檢查新感染的方法，特別對兒童。2 .尾蝴膜反應(yīng)(CHR(1)原理：血吸蟲尾蝸抗原與患者血清特異性抗體在體外共同孵育后，在尾蝴體表面形成折光性套膜。(2)應(yīng)用：早期診斷血吸蟲病，有較高的特異性和敏感性。3 .環(huán)卵沉淀試驗(yàn)(COPT環(huán)卵沉淀試驗(yàn)(COPT是以血吸蟲整卵為抗原的特異免疫血清學(xué)試驗(yàn),卵內(nèi)毛蝴或胚胎分泌排泄的抗原物質(zhì)經(jīng)卵殼微孔滲出與檢測血清內(nèi)的特異抗體結(jié)合，可在蟲卵周圍形成特殊的復(fù)合物沉淀，在光鏡下判讀反應(yīng)強(qiáng)度并計(jì)數(shù)反應(yīng)卵的百分率稱環(huán)沉率。COPTT作為診斷血吸蟲病的血清學(xué)方法之一及臨床治療病人的依據(jù)；可用于考核治療和防治

9、效果；并可用于血清流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測疫情。第3頁共6頁4 .間接血凝試驗(yàn)（IHA）間接血凝試驗(yàn)（IHA）是以紅細(xì)胞作免疫配體的載體，并以紅細(xì)胞凝集讀數(shù)的血清學(xué)方法。最常用的紅細(xì)胞為綿羊或人（O型）紅細(xì)胞，來源方便。目前均用醛化紅細(xì)胞，可保存半年而不失其免疫吸附性能?？煞譃殚g接血凝（IHA）,反向間接血凝（RIHA）、間接血凝才制試驗(yàn)（IHAI）和反向間接血凝抑制試驗(yàn)（RIHAI）,可以檢測抗原或抗體，有較高的敏感性和一定的特異性。單克隆抗體的應(yīng)用使敏感性和特異性有所提高。IHA操作簡便，敏感性高，適于現(xiàn)場使用，可用于輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。可在多種寄生蟲感染中應(yīng)用，如血吸蟲，瘧疾、豬囊蟲、旋毛

10、蟲、肺吸蟲、阿米巴、弓形蟲和肝吸蟲等。有些已制成商品診斷藥盒。不足之處是不能提供檢測抗體的亞型類別，容易發(fā)生異常的非特異凝集。另外抗原的標(biāo)準(zhǔn)化和操作方法規(guī)范化有待解決，以提高其診斷效果和可比性。5 .免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)（IFA）是用熒光素標(biāo)記的抗體檢測抗原或抗體的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)，常用于病原體感染的熒光抗體染色主要有直接法與間接法。（1）直接法：用于檢測抗原，其缺點(diǎn)是每查一種抗原必須制備與其相應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體。目前很少應(yīng)用。（2）間接法：也稱間接熒光抗體法。本法的優(yōu)點(diǎn)是制備一種熒光標(biāo)記的抗體，可以用于多種抗原-抗體系統(tǒng)的檢查，既可用于測定抗原，也可測定抗體?？捎糜跈z測組織內(nèi)的寄生蟲，如利

11、什曼原蟲、阿米巴、瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、華支睪吸蟲、并殖吸蟲、絲蟲、囊蟲、包蟲、旋毛蟲等。IFA的抗原可用蟲體或含蟲體的組織切片或涂片，經(jīng)充分干燥后低溫長期保存?zhèn)溆谩Ｒ粡堓d片可等距置放多個抗原位點(diǎn)，同時(shí)檢測多個樣本或確定滴度；也可將多種抗原底物放在一起切片，用以過篩。6 .酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）簡稱酶聯(lián)試驗(yàn)，已廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液（血清，腦脊液等）以及排泄分泌物（尿，孚L,糞便等）內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測。根據(jù)檢測要求，試驗(yàn)可分多種類型，常用者有：用于檢測抗體的間接法；檢測IgM的雙夾心法、檢測抗原的雙抗體夾心法、以固相抗體檢測抗原的競爭法以及競爭抑制法

12、等。ELISA為高靈敏檢測技術(shù)，結(jié)果可定量表示，可檢測抗體、抗原或特異性免疫復(fù)合物，微量滴定板法消耗樣本試劑少，能供全自動操作，適用批量樣本檢測，因此在寄生蟲感染的研究和診斷領(lǐng)域乃至血清流行病學(xué)均被廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外有多種寄生蟲感染的ELISA試劑盒出售，包括有血吸蟲病、弓形蟲病、阿米巴病、絲蟲病、肺吸蟲病、棘球蝴病、隱抱子蟲病、卡氏肺抱子蟲病、囊蟲病、蛔蟲病、旋毛蟲病和犬蛔蟲病等。三、單克隆抗體在寄生蟲病診斷中的應(yīng)用單克隆抗體的特異性高，但敏感性常不及多克隆抗體。目前，已有應(yīng)用于瘧原蟲抗原、瘧原蟲循環(huán)抗原、血吸蟲循環(huán)抗原、血吸蟲蟲卵抗原檢測，以及絲蟲病、囊蟲病、弓形蟲病等寄生蟲病的診斷。四、D

13、N琳針技術(shù)在寄生蟲病診斷中的應(yīng)用DNA探針技術(shù)（分子雜交技術(shù)）在寄生蟲病診斷中的應(yīng)用主要有兩個方面：一是進(jìn)行種、株鑒定等分類學(xué)研究；二是用于寄生蟲病的診斷及流行病學(xué)研究。由于是直接檢測寄生蟲DNA片段，因而比免疫血清學(xué)方法可靠、穩(wěn)定。目前已用DNA探針技術(shù)作為診斷工具的寄生蟲病有：瘧疾、弓形蟲病、利什曼病、血吸蟲病、絲蟲病等。經(jīng)典例題檢查瘧原蟲及絲蟲時(shí)，常用的標(biāo)本是A.血液B.大便第4頁共6頁C.尿液D.骨髓E.唾液正確答案A答案解析檢查瘧原蟲及絲蟲時(shí)，常采用厚血膜法。染色實(shí)驗(yàn)用于檢查A.肝吸蟲B.肺吸蟲C.瘧原蟲D.弓形蟲E.血吸蟲正確答案C答案解析瘧原蟲檢查常用血涂片吉姆薩或瑞氏染色鏡檢法（厚、薄血膜法）、血涂片口丫咤橙染色法等。陰道毛滴蟲的檢查方法，錯誤的是A.生理鹽水涂片法B.涂片后染色C.血涂片D.尿沉渣涂片E.前列腺分泌物涂片正確答案C答案解析陰道毛滴蟲主要寄生于女性陰道和尿道內(nèi)，也可寄生于男性尿道和前列腺內(nèi)，引起滴蟲性陰道炎、尿道炎或前列腺炎。確診寄生蟲病的主要實(shí)驗(yàn)室