血流感染實驗室診斷（課堂PPT）

1、1血流感染實驗室診斷新進(jìn)展血流感染實驗室診斷新進(jìn)展北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科王瑤2013年4月13日2內(nèi)容 什么是血流感染？ 血流感染流行病學(xué)特點 血培養(yǎng)流程優(yōu)化 提高陽性率 分析培養(yǎng)結(jié)果 減少污染 分子生物學(xué)方法檢測血流感染 基于PCR的技術(shù) MALDI-TOF MS PNA-FISH3概念 感染炎癥+病原體 全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS） 體溫38C或90次/分 呼吸頻率20次/分，或PaCO212109/L或10% 膿毒血癥（sepsis）感染+SIRS，血培養(yǎng)可以陽性或陰性 重度膿毒血癥（severe sepsis）sepsis+臟器功能障礙、組織灌注不良和低血壓 感染性休克（septic s

2、hock）4概念 敗血癥（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的臨床綜合征，是一種嚴(yán)重的全身感染。病原菌主要是細(xì)菌，也可為真菌、分枝桿菌等。 菌血癥（bacteremia）：細(xì)菌在血流中短暫出現(xiàn)的現(xiàn)象，一般無明顯毒血癥狀，在國外文獻(xiàn)中常與敗血癥通用。 血流感染（bloodstream infection, BSI）：敗血癥和菌血癥目前統(tǒng)稱為血流感染。5血流感染 醫(yī)院獲得性血流感染 原發(fā)血流感染 實驗室證實血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI） 臨床血流感染（Clinical Sepsis） 繼發(fā)血流感染：血培

3、養(yǎng)分離出有意義微生物，而且此微生物與另一部位之院內(nèi)感染有關(guān)。唯不包括血管或血管內(nèi)導(dǎo)管裝置所引起之血流感染。 社區(qū)獲得性血流感染6實驗室證實血流感染（LCBI）標(biāo)準(zhǔn)一：從一次或多次血標(biāo)本中培養(yǎng)出一種一致的致病菌，而且培養(yǎng)出的病原體與其它部位的感染無關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)二：病人至少具有下列癥狀和體征之一：發(fā)熱（38 C ），寒顫或低血壓，并致病符合下列之一： 1.從兩次或兩次以上不同部位抽血的標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌（如類白喉桿菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌）。 2.至少一次從帶血管內(nèi)導(dǎo)管的病人血標(biāo)本中培養(yǎng)出皮膚寄生菌群（如類白喉桿菌、芽孢桿菌、丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌或微球菌），并且主

4、管醫(yī)生開始了適當(dāng)?shù)目咕幬镏委煛?3.血中抗原檢測陽性（如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌或B群鏈球菌）。與實驗室陽性結(jié)果一致的癥狀和體征與其它部位的感染無關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)三：年齡38 C ），低溫（37 C ），呼吸暫停、脈搏徐緩，并具有下列之一（同上3點略）7臨床血流感染（Clinical Sepsis）具有下列二條件之一者：具有非其它已知原因所引起的發(fā)燒、血壓過低（收縮壓90mmHg或收縮壓低于平常超過40mmHg），少尿（每小時尿量低于30ml）等臨床癥狀任何一項，且符合下列所有條件者： 未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者 其它部位無明顯感染者 醫(yī)生針對此感染中毒癥狀給予適當(dāng)

5、抗菌藥物治療1歲以下嬰兒 ，具有非其它書籍原因引起的發(fā)燒、體溫過低、呼吸中止或心跳過緩等臨床癥狀任何一項，且符合下列所有條件者： 未做血培養(yǎng)，或血培養(yǎng)陰性或血液抗原反應(yīng)呈陰性者 其它部位無明顯感染者 醫(yī)生針對此感染中毒癥狀給予適當(dāng)抗菌藥物治療8BSI流行病學(xué)特點 BSI發(fā)病率逐年增加 凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌、真菌血流感染發(fā)病率逐年上升，革蘭陰性菌下降 耐藥菌比例逐年增加 社區(qū)獲得與醫(yī)院獲得血流感染病原譜存在差異 院內(nèi)BSI患者病死率高9美國膿毒血癥流行病學(xué)+600%+300%+300%Martin et al, NEJM 2003;348:154610加拿大CANWORD監(jiān)測2002-20

6、09Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 30711加拿大CANWORD監(jiān)測2002-2009Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 30712美國49醫(yī)院BSI病原譜CID. 2004, 39: 309-31713PUMCH2012年834血培養(yǎng)分離株14PUMCH2012年144株BSI大腸埃希菌藥敏結(jié)果ESBL 60.2%15PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果ESBL 34.4%16PUMCH2012年61株BSI鮑曼不動桿菌藥敏結(jié)果17PUMCH2012年76株BSI金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果18P

7、UMCH2012年46株BSI草綠色溶血鏈球菌藥敏結(jié)果192011CHIF-NET489株BSI酵母菌202011CHIF-NET念珠菌對氟康唑的敏感性212011CHIF-NET念珠菌對伏立康唑的敏感性222011CHIF-NET其他酵母菌對氟康唑的敏感性232011CHIF-NET其他酵母菌對伏立康唑的敏感性24采血量是影響血培養(yǎng)陽性率的獨立相關(guān)因素 CLSI M47-A：每位患者采集23套血培養(yǎng)（4060ml） Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide)：抗菌藥物治療前至少采集2套血培養(yǎng) 英國NHS血培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)：采集2套血培養(yǎng)25采血量

8、對血培養(yǎng)陽性率的影響JCM 200726采血量對血培養(yǎng)陽性率的影響J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):404727J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047 Routine Set Mayo Clinic:2 BACTEC Aerobic Plus Bottles + 1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle采血量和陽性率非條件致病菌28 在多次血培養(yǎng)中單次培養(yǎng)下列細(xì)菌陽性 凝固酶陰性葡萄球菌 棒狀桿菌 微球菌 丙酸桿菌 芽孢桿菌 如多次培養(yǎng)陽性，可能為條件致病菌，需結(jié)合臨床分析血培養(yǎng)污染菌29非條件致病菌Ma

9、yo Clinic(p38C or 90/min; 呼吸 20/min; 白細(xì)胞12 or 10% 未成熟中性粒細(xì)胞 32%患者有1瓶以上CNS陽性，BSI68 %，污染12% (p 0.001) 沒有SIRS癥狀：BSI 5%，污染29% (p 30秒1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：從穿刺點向外畫圈消毒,直徑3cm70%酒精脫碘 一步法葡萄糖酸洗必泰作用30 s，或70%異丙醇消毒后自然干燥，但不適用于2個月以內(nèi)的新生兒。38急診血培養(yǎng)污染率與工作量相關(guān) The University of Michigan Health System急診 血培養(yǎng)大多數(shù)由采血員采集，其次為護(hù)士和醫(yī)生

10、 采血員:病人= 1:9，重癥區(qū)護(hù)士:病人= 2:3，其它區(qū)域護(hù)士:病人=1:4 年病人量82521人，采集血培養(yǎng)者7586人 11.4%至少1瓶陽性，病原菌陽性率8.0%，污染率3.7% 多套培養(yǎng)患者陽性率7.4%，單套培養(yǎng)陽性率5.1%（p0.001），污染率無顯著差別（2.2% vs. 2.6%）Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online39急診小時工作量Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online40繁忙時血培養(yǎng)污染率增加OR=1.23OR=0.93Schuyler Halverson, et al.

11、 JCM. 2013 online41抗菌藥物治療與血流感染死亡率死亡率Chest 115 (2): 199942血培養(yǎng)三級報告制度血培養(yǎng)血培養(yǎng)陽性陽性終報告終報告革蘭染色革蘭染色傳種培養(yǎng)傳種培養(yǎng)初步報告初步報告 (直接藥敏直接藥敏)鑒定菌株鑒定菌株電話報告電話報告鑒定標(biāo)準(zhǔn)藥敏鑒定標(biāo)準(zhǔn)藥敏43血培養(yǎng)結(jié)果回報對治療的影響 A = Appropriate Therapy(正確治療) I = Inappropriate Therapy(不正確治療)Clin Infec Dis 24:584-602, 199744血流感染快速分子診斷 分子診斷不受抗菌藥物使用的影響 血培養(yǎng)陽性后分子診斷 直接使用血標(biāo)

12、本進(jìn)行分子診斷 快速 但不能提供藥敏結(jié)果45血培養(yǎng)陽性瓶分子鑒定Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):20946陽性血培養(yǎng)基于PCR的檢測 PCR特異性檢測 病原特異性PCR 特定耐藥基因檢測：葡萄球菌mecA, 腸球菌van 細(xì)菌載量：肺炎鏈球菌自溶毒A基因lytA拷貝數(shù) 廣譜檢測：PCR擴(kuò)增特定靶位 多態(tài)性分析 測序 后續(xù)基因檢測 種特異性real-time PCRExpert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(

13、2):13747qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌 Target：ecfX gene 血培養(yǎng)系統(tǒng)：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均顯示G-b 對照方法：氧化酶，API 20E DNA提?。?.5ml肉湯，離心后加裂解液，水煮法 定量PCR： 擴(kuò)增：Oligonucleotide primers 基因特異性檢測：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragmentAnnal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:2148qPCR鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中銅綠假單胞菌 33瓶pae，敏感性和特異

14、性均為100% 1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)kpn (108CFU/ml)，PCR(-) 檢測限：將ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coliAnnal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:2149陽性血培養(yǎng)基于PCR的檢測 最常見病原體多重PCR 電泳譜、ELISA雜交、多重Real-time PCR Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成 Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：

15、多重real-time PCR+微陣列分析，檢測多種病原及mecA，3h完成 多重Real-time PCRExpert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.50血培養(yǎng)陽性多重real-time PCRNEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 201351血培養(yǎng)陽性多重real-time PCRNEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 201352血培養(yǎng)陽性PNA FISH核酸熒光原位雜交 血培養(yǎng)陽性肉湯革蘭染色PNA FISH革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeEfa/其它腸球Sau/scnCal/cgl/其它念

16、珠菌報道Salmonella spp.90min PNA FISH完成Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247 53MALDI-TOF MS 基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI） 原理：將樣品分散在基質(zhì)分子中形成結(jié)晶后直接進(jìn)樣，當(dāng)用激光照射結(jié)晶時，基質(zhì)吸收了激光的大部分能量，使基質(zhì)分子和樣品獲得能量投射到氣相并得到電離，成為帶電荷的離子。 基質(zhì)在樣品離子形成過程中起到了質(zhì)子化或去質(zhì)子化的作用，使樣品帶上正電荷或負(fù)電荷，成為帶電荷

17、的離子 基質(zhì)會干擾被檢測分子質(zhì)譜峰的大小和濃度；不同類型的分析物選擇不同的基質(zhì)54MALDI-TOF MS 飛行時間（TOF） 原理：離子源產(chǎn)生的離子在加速電場獲得動能，當(dāng)進(jìn)入高真空無電場飛行管道并在此管道內(nèi)飛行時，質(zhì)量較輕的離子飛行速度快，早到達(dá)檢測器；質(zhì)量較重的離子飛行速度慢，晚到達(dá)檢測器。因此依據(jù)離子的飛行時間與其質(zhì)荷比平方根（m/z）成正比的關(guān)系，通過測定飛行時間，計算出相應(yīng)離子的分子量。55MALDI-TOF MS操作步驟56MALDI-TOF MS快速鑒定陽性血培養(yǎng) 使用菌落、陽性血培養(yǎng)肉湯鑒定 快速：20分鐘(從報警到鑒定出結(jié)果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACT

18、EC(BD): 正確鑒定：193/213陰性菌（包括厭氧菌）(90.61%)，284/319陽性菌(89.02%) 80.9%復(fù)數(shù)菌正確鑒定出一種，7株緩癥鏈球菌鑒定為spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux): 388個陽性瓶，種正確率91%（包括念珠、厭氧菌） 15瓶復(fù)數(shù)菌：使用通用庫多鑒定出一種，革蘭染色后使用陰性或陽性庫分析，6瓶鑒定出第二種菌Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 154257MALDI-TOF MS VITEK MS(bioMrieu

19、x) 以16s為金標(biāo)準(zhǔn)，980株臨床分離株，ID正確率 腸桿菌科97.7% 非發(fā)酵菌92% 葡萄球菌屬94.3% 鏈球菌屬84.8% HACEK84% 酵母菌85.2%J Clin Microbiol. 2010; 48: 90058PCR/ESI MS 廣譜PCRESI MS（電噴射質(zhì)譜） 189陽性血培養(yǎng)和45陰性血培養(yǎng)，種一致率98.7% 6例spn標(biāo)本方法陰性 提供定量結(jié)果評估病原體載量 假陰性率24%：幾乎均由混合感染導(dǎo)致 5-6h完成檢測 結(jié)合PCR的敏感性和ESI MS特異性 可以直接檢測標(biāo)本，不需要培養(yǎng)Proc Natl Acad Sci. 2005;102:801259血標(biāo)本

20、分子檢測 種特異性、屬特異性、廣譜、多重PCR、微陣列分析 血培養(yǎng)陰性的苛養(yǎng)菌，如Bartonella spp.巴爾通體, Coxiella burnetii伯氏考克斯體, Mycoplasma spp.支原體, Chlamydia spp.衣原體, Ricketssia spp.立克次體，Tropheryma whipplei60商品化分子生物學(xué)檢測方法:血標(biāo)本 SeptiFast(Roche)：multiplex real-time PCR，種屬特異性熒光探針，檢測重要血流感染致病菌 SepsiTestTM (Molzym)：eubacterial and panfungal real-t

21、ime PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌 VYOO (SIRS Lab)：multiplex PCR，檢測重要血流感染菌，電泳分離擴(kuò)增片段 Plex-ID (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+質(zhì)譜，幾乎可以鑒定所有細(xì)菌、真菌Intensive Care Med. 2011 May, publish online. 61SeptiFast test檢測的病原譜BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:495662