細(xì)胞培養(yǎng)液的配制ppt課件

1、細(xì)胞培育液的配制 培育基的選擇 根據(jù): 閱歷、文獻(xiàn)、嘗試 常用: RPMI1640、DMEM 培育基的來源 市售干粉培育基-本人配制 液體培育基-直接運(yùn)用(留意有效期) 培育基的除菌方法 過濾除菌: (1) 正壓過濾-效率高 (2) 負(fù)壓過濾-效率低 高壓蒸氣滅菌: 不含谷氨酰胺，滅菌后另外添加培育基附加成分的添加 按運(yùn)用闡明或?qū)嶒?yàn)要求添加 配制時(shí)加: 碳酸氫鈉、抗生素、血清等 臨用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等 RPMI1640培育液配制過程 預(yù)備物品 (1) 不銹鋼過濾器, 濾膜(0.45m,0.22m),磁力攪拌器,天平,燒杯,量筒,鹽水瓶 (2) 培育粉,1N

2、 HCl,NaHCO3,青霉素,鏈霉素,胎牛血清,新穎三蒸水 消毒物品 濾器中放置0.45m和0.22m濾膜, 包裝, 高壓蒸氣消毒配制步驟 (1) 10.4g/(1) 10.4g/包培育粉溶至包培育粉溶至1L1L三蒸水中三蒸水中, , 磁力攪磁力攪拌拌20min20min(2) (2) 加加2g NaHCO3/L, 2g NaHCO3/L, 繼續(xù)攪拌繼續(xù)攪拌10min10min(3) (3) 加青霉素加青霉素100U/mL(80100U/mL(80萬萬U U溶至溶至4ml4ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml)0.5ml) 鏈霉素鏈霉素100U/mL(100100U/mL(100萬萬U U

3、溶至溶至5ml5ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml)0.5ml)(4) (4) 加加1N HCl1N HCl約約3mL, 3mL, 調(diào)調(diào)pHpH至至7.2, 7.2, 繼續(xù)攪拌繼續(xù)攪拌(5) (5) 按要求加血清血清普通需經(jīng)按要求加血清血清普通需經(jīng)5656，30min30min滅活滅活 例如例如: 10%: 10%胎牛血清胎牛血清 無血清培育液無血清培育液 900ml 900ml 滅活胎牛血清滅活胎牛血清 100ml 100ml(6) (6) 正壓過濾除菌正壓過濾除菌 ( (氣壓適當(dāng)氣壓適當(dāng), , 防止濾膜破裂防止濾膜破裂) )(7) (7) 分裝分裝, ,儲(chǔ)存于儲(chǔ)存于44，2 2周內(nèi)用完

4、。周內(nèi)用完。(8) (8) 無菌實(shí)驗(yàn)無菌實(shí)驗(yàn): : 取樣取樣, 37, 37放置放置242472h, 72h, 無細(xì)無細(xì)菌、霉菌污染方可運(yùn)用菌、霉菌污染方可運(yùn)用本卷須知 谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，分解，分解，放置兩周以上時(shí)，根據(jù)需求添加谷氨酰胺。，放置兩周以上時(shí)，根據(jù)需求添加谷氨酰胺。配制配制母液母液200 mmol/L, 200 mmol/L, 即即29.22g/L29.22g/L, , 每每100ml100ml參與參與0.50.52 ml2 ml母液，終濃度母液，終濃度1 14 4 mmol/L mmol/L 抗生素在抗生素在3737穩(wěn)定性維持穩(wěn)定性維持3 34d

5、, 4d, 可控制輕度污可控制輕度污染。防污染重在無菌操作染。防污染重在無菌操作 培育液配制過程 以RPMI1640為例1. 物品預(yù)備(1濾器、 微孔濾膜、磁力攪拌器、天平、燒杯、量筒、pH計(jì)、貯液瓶等。 (2) (2) 培育粉、培育粉、 NaHCO3 NaHCO3、 1N HCl1N HCl、青霉素、鏈霉、青霉素、鏈霉素、血清、新穎制備的素、血清、新穎制備的三蒸水三蒸水取孔徑為取孔徑為0.45m0.45m和和0.22m0.22m濾膜各一張，浸入三蒸水中濾膜各一張，浸入三蒸水中 將浸濕后的濾膜光面向上依次置于濾器上將浸濕后的濾膜光面向上依次置于濾器上將裝有濾膜的濾器包裝后高壓蒸氣消毒將裝有濾膜

6、的濾器包裝后高壓蒸氣消毒 將培育粉倒入容器中將培育粉倒入容器中參與新穎制備的三蒸水磁力攪拌器充分?jǐn)嚢鑵⑴c新穎制備的三蒸水磁力攪拌器充分?jǐn)嚢璋凑諏?shí)驗(yàn)的詳細(xì)要求分別參與按照實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)要求分別參與 NaHCO3 NaHCO3和青鏈霉素和青鏈霉素青霉素青霉素100U/mL100U/mL：8080萬萬U U溶至溶至4ml4ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml0.5ml； 鏈霉素鏈霉素100U/mL100U/mL：100100萬萬U U溶至溶至5ml5ml三蒸水三蒸水, , 取取0.5ml)0.5ml)按要求參與一定比例的按要求參與一定比例的血清血清普通需經(jīng)血清血清普通需經(jīng)5656，30min30min滅活滅活 例如例如: : 配制含配制含10%10%胎牛血胎牛血清的清的RPMI1640RPMI1640培育液培育液1 1升，應(yīng)參與升，應(yīng)參與 無血清培育液無血清培育液900ml900ml 滅活胎牛血清滅活胎牛血清100ml100ml參與參與1N HCl1N HCl約約3mL,3mL,調(diào)整調(diào)整pHpH至至7.27.27.47.4磁力攪拌器充分磁力攪拌器充分?jǐn)嚢钄嚢桀A(yù)備過濾預(yù)備過濾 無菌條件下裝好濾器，檢查氣體以及液體管道能否通暢。無菌條件下裝好濾器，檢查氣體以及液體管道能否通暢。 ( (普通運(yùn)用氧氣。留意氣壓適當(dāng)普通運(yùn)用氧氣。留意氣壓適當(dāng), , 防止濾膜破裂，防止濾膜破裂，)