力學刺激對種植體

1、力學刺激對植體-骨界面骨系細胞mRNA表達的影響Effects of the mRNA expression in implant-bone interface bone cells after mechanical stimulate摘要在建立力學刺激骨系細胞的動物實驗模型的基礎上，利用激光捕獲顯微分離技術（LCM）, 獲取動物模型體內種植體骨界面區(qū)域的成骨細胞和破骨細胞,用基因芯片法檢測不同力值的間斷力學刺激作用下基因表達譜的時序變化。明確從骨形成到骨破壞這個質的變化過程中，基因表達的差異和相關的特異性基因，探討成骨細胞和破骨細胞的耦聯(lián)機制，從系統(tǒng)角度研究生理負荷促進骨形成和超負荷導致骨破

2、壞的基因調控機制的差異，嘗試篩選出與骨形成和骨破壞相關基因，以為骨生物力學及骨組織工程學提供理論依據，并進一步完善負荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建機制的理論，為臨床診斷和防治提供理論先導。（一）立項依據與研究內容1、項目的立項依據（附主要的參考文獻目錄）。隨著醫(yī)學科學的發(fā)展，一些人工種植體或裝置越來越多的被植入骨組織，用于治療病變和修復缺損，如人工關節(jié)、牙種植體，以及骨內固定裝置等。理想的人工種植體或裝置應以與骨組織緊密結合(骨整合Osseointegration)的形式行使其生理功能, 然而，仍有部分植入體不能達到或保持長期的骨整合，導致植入體松動、脫落和并發(fā)癥的產生，除了植入體材料本身

3、的因素之外，負荷后骨組織的應力變化也是重要的影響因素之一，且已引起眾多學者的關注。由于植入體與骨組織之間始終存在一個界面，負載后界面骨組織的應力應變與正常骨組織負載后的應力應變不同，這種力學環(huán)境的改變，可能會促進骨組織與人工材料的界面發(fā)生適應性改建，達到理想的骨整合；也可能會導致骨組織與人工材料的界面發(fā)生骨吸收。骨吸收會使種植體與骨組織分離，增加了植入物微粒、細菌及炎癥介質等侵入的機會，引起炎癥反應，加速骨吸收并造成植入體松動，進而影響種植體的生存率和生存時間。因此，了解力學刺激對骨組織與人工材料界面骨改建的影響，將有助于解釋臨床觀察到的現象，有助于與骨生物力學相關的諸學科的發(fā)展，如骨折固定、

4、人工關節(jié)置換、牽張成骨、口腔種植修復、口腔正畸、骨質疏松癥的防治及骨組織工程研究等等。機械刺激產生的耦合力傳遞到骨組織，使骨系細胞發(fā)生應力應變作用，這些變化通過多個信號轉導通路的轉導，導致骨系細胞產生多種生物學效應并完成骨的改建。成骨細胞(OB)和破骨細胞(OC)是骨改建的兩大主要功能細胞，在應力、生長因子、激素等作用下兩者之間相互作用，相互調控，使骨產生適應性地構建。其中由應力應變造成細胞的生物學反應和變化，引起了人們的關注1，多數學者認為2：不同的力學刺激可以導致成骨細胞、破骨細胞活性和數量的變化，影響骨形成與骨吸收，而這顯然是由于骨系細胞基因表達和基因調控發(fā)生變化的結果。目前的研究證據表

5、明：1、體外培養(yǎng)成骨細胞加載研究證明3-5：成骨細胞未受力時, 早期即刻基因c-fos、c-jun在細胞靜止期內不表達；受力學刺激后初期即明顯增加，其表達一般與細胞的增殖分化同時出現，因而其轉錄翻譯蛋白可能對其它晚應答的基因轉錄起調控作用。Ikegame等6發(fā)現：加載6h后，骨形成蛋白-4（BMP-4）基因表達增加，成骨特異性轉錄因子cbfa1/Osf-2也隨著BMP-4基因表達開始表達。Pavlin等7發(fā)現：加載24h后，成骨細胞中骨鈣蛋白水平輕度下降，但在加載1-2d，其表達增長了4.6倍，到第4d則增長了7倍，達到其增長的最高峰；I型膠原基因的表達在加載后第1d不明顯，但在第2d其表達增

6、長了3倍，并在其后6d維持這一水平。Cillo等8則針對另外一些重要的基因表達進行了研究：實驗中發(fā)現拉伸應力可以使TGF-和胰島素樣生長因子-II的mRNA表達增加，堿性成纖維細胞生長因子表達減少，且不同的力值和加載時間對這些基因的表達有不同的影響。顯然成骨細胞受力后，基因的表達在一定的時間范圍內存在明顯的時序性變化。2、破骨細胞是骨吸收的主要功能細胞，傳統(tǒng)認為破骨細胞是一個“惰性細胞”，對力學刺激不敏感，主要是通過成骨細胞感受力學刺激以后，通過耦聯(lián)機制影響破骨細胞的活性、增殖和遷移。但是最近的研究表明9：應力可直接導致體外培養(yǎng)的破骨細胞mRNA表達的增強，并伴隨著骨吸收能力的增強。3、多數實

7、驗是建立在對OB、OC靜態(tài)加載的基礎上，但動態(tài)載荷對骨改建的影響遠大于靜態(tài)載荷，已得到很多學者證實，即間歇性的周期性力學刺激對細胞的增殖分化功能和基因表達的作用明顯大于持續(xù)性靜態(tài)負荷的作用10-11。但其原因和機理尚不清楚。4、對力學信號轉導的研究表明12-14：骨系細胞表面的離子通道在細胞膜受到力學作用數秒或數分鐘后即可引起G蛋白活化、第二信使釋放、蛋白質磷酸化、生長因子的分泌、細胞骨架的變化、細胞和細胞外基質粘附的重建，最終導致基因表達的變化。基因表達的變化可能反過來影響信號的轉導 13。成骨細胞在某些力學刺激因素作用下表達一些因子，從而將骨吸收信號傳遞給破骨細胞的前體細胞，使之分化發(fā)育并

8、活化，行使骨吸收功能。骨保護素（OPG）和骨保護素配體（OPGL）的發(fā)現證實了這一假說，并提供了分子基礎13-14。有研究表明14-15：作為細胞表面重要受體的整合素，通過識別某些胞外基質蛋白，介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質的粘附反應并接受、轉導級聯(lián)信號，并有可能是力學信號傳遞的通道。從以上研究中可以看出：（1）力學刺激導致OB、OC基因改變的過程涉及眾多基因的變化，但針對個別基因的研究顯得較為凌亂，基因之間的相互影響也不清楚，不能精確地闡明各基因在這一過程中的作用。（2）多條信號轉導通路之間存在著密切的耦聯(lián)關系，不同的力學信號可能通過這些內在相連的信號通路，以不同的方式影響骨系細胞的反應。

9、這些不同信號通道是如何介導力學刺激，而導致OB、OC基因表達的時空變化？是否存在某些尚不為人所知的信號轉導分子？信號通路之間又是如何耦聯(lián)的？這方面的認識尚不明確，只能從基因表達的變化來找尋方向。（3）由于各學者多采用體外實驗，實驗條件不盡相同，導致實驗結果的可比性較差，有關體內實驗的報道，特別是力學刺激對人工種植體-骨界面骨系細胞基因表達影響的報道也極為罕見。因此，有必要同期從體內外觀察OB、OC受力后整個基因表達的時序變化，探討各相關基因在骨形成和骨吸收過程中的確切作用，并探討其臨床應用前景和意義。Vaes16等人曾嘗試應用基因芯片的方法，找尋骨形成蛋白-2誘導成骨細胞分化過程中的標記基因，

10、為探尋力學信號對骨系細胞基因表達的影響提供了一個好的思路。基因芯片技術是一項新興的能檢測全范圍mRNA表達水平變化的技術，具有高通量、并行化的特點，可為研究基因調控網絡及其機理，揭示不同層次多基因相互作用的生理、病理現象提供有效手段17,18。然而，骨組織是不同細胞群體相互作用的三維空間結構，通過磨碎活組織所提取的DNA、RNA不能代表特定生理或病理過程中單一同類細胞的信息。激光捕獲顯微切割技術19（Laser Capture Microdissection ，LCM）則是解決細胞異質性問題的革命性技術，是在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細胞群或單個細胞的技術。從LCM捕獲的同質細胞中

11、提取mRNA可構建cDNA文庫，進行cDNA微列陣分析20。因此，我們相信LCM技術與基因芯片的有效結合，將能夠清晣地勾畫出力學刺激后人工種植體-骨界面OB、OC在生理、病理過程中的基因表達的改變。綜上所述，骨作為一個自適應的生物系統(tǒng)是通過多層面、多因素的網絡調控來完成應力作用下的骨改建，顯然以往只針對其中某一層面、若干因素的單一視角的研究，難以系統(tǒng)透徹地闡述應力作用下骨形成和骨吸收的基因調控機制。因此有必要從整個基因組的水平探討應力作用下骨系細胞上千個基因的動態(tài)表達，既要從分子水平來研究其機理，也要從系統(tǒng)層面動態(tài)研究骨系細胞基因的時序變化，把分析和綜合統(tǒng)一起來，同時也可以對目前眾多單基因水平

12、的研究進行分析、評價和比較，從而明確不同力學刺激導致骨形成和骨吸收的基因調控的異同，試圖發(fā)現新的重要的調控基因，篩選出能特異性表明骨形成和骨吸收的“標記”基因，不僅為骨生物力學及骨組織工程學提供理論依據，而且對負荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建機制的認識、臨床診斷和防治等也有重要的意義。參考文獻：1、Lee TC, Staines A, Taylor D. Bone adaptation to load: microdamage as a stimulus for bone remodelling. J Anat. 2002 Dec;201(6):437-46.2、Femor B,Cundl

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24、 with activin by combination of subtractive hybridization and microarray technologies.Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 2;313(1):104-9.2、項目的研究內容、研究目標,以及擬解決的關鍵問題。研究內容：第一部分：建立將力學刺激傳遞到骨系細胞的動物實驗模型，通過動物實驗驗證間斷力學刺激與骨形成和骨破壞之間的關系，確定本實驗中擬采用的“生理”負荷和“超”負荷的標準力值。第二部分：體外培養(yǎng)OB和OC，采用基因芯片法檢測不同力值的間斷力學刺激下OB和OC基因表達譜的時

25、序變化。第三部分: 利用激光捕獲顯微分離技術, 采集動物模型體內種植體骨界面區(qū)域的OB和OC,再用基因芯片法檢測“生理”負荷和“超”負荷下各類細胞基因表達譜的時序變化。第四部分：采用RT-PCR方法，對骨形成和骨破壞過程中OB、OC基因表達變化差異最大的幾個基因進行檢測和驗證。第五部分：統(tǒng)計學分析比較體內外OB、OC基因表達的時序變化和差異，分析從骨形成到骨破壞過程中整個基因組表達的差異及其作用機制。研究目標：本研究擬通過體內外實驗，探討從骨形成到骨破壞這個質的變化過程中骨系細胞基因表達的差異，從整體角度分析“生理”負荷促進骨形成和“超”負荷導致骨破壞的基因調控機制，明確相關的特異性基因表達，

26、探討OB和OC在力學刺激下的耦聯(lián)機制，探索未知的相關調控基因或信號轉導相關基因，從而為與骨生物力學相關的臨床學科提供分子水平的理論基礎以及臨床應用的指導。擬解決的關鍵問題1）、建立動物模型，確定本實驗中擬采用的“生理”負荷和“超”負荷的標準力值。2）、通過體內體外OB和OC，在間斷力學刺激下不同時間點取樣的基因表達譜的比較，研究骨系細胞基因表達的時序變化。3）、通過體內體外OB和OC基因表達譜差異的對比分析，探討OB和OC的耦聯(lián)機制。4）、通過探索骨形成和骨破壞過程中OB和OC特異性基因表達的種類和豐度，嘗試找尋相應的“標記”基因。5）、通過基因表達譜的比較，結合基因數據庫的數據，結合重要調控

27、基因的發(fā)現，從整體角度分析負荷狀態(tài)下骨組織與人工材料界面骨改建的機制，為進一步研究提供新的線索和思路。3、擬采取的研究方案及可行性分析。研究方案一）、實驗動物模型的建立及間斷力學刺激對骨系細胞影響的觀察1）、選6月齡SD大鼠60只，雌雄各半，分別單側股骨植入純鈦種植體（2.0，L 8）骨外暴露4mm，以備加力用，2-3月后，X光驗證骨整合者備用。 2）、隨機分為5組，Zwick1454自動材料萬能試驗機分別以0N，5N，10N，20N，40N力值、2HZ的頻率給種植體軸向加載，每天3次，每次1小時，連續(xù)3周。如種植體明顯松動，停止加載，取材檢測。3）、3周后取材， 通過骨形態(tài)學計量方法分別檢測

28、各種植體周圍骨質的骨小梁表面成骨細胞數、骨小梁表面破骨細胞數、有成骨細胞被覆的類骨質表面占骨小梁總表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁總表面的百分比等相關指標檢測。4）、各指標經統(tǒng)計學分析，確定臨界負荷及本課題將采用的“生理”負荷和“超”負荷的標準力值。二）、體外培養(yǎng)的成骨細胞、破骨細胞在間斷力學刺激下基因表達譜的基因芯片檢測1）、體外培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞，觀察不同負荷下的生物學性狀。（已積累經驗）2）、將前期實驗測出的標準“生理”負荷和“超”負荷換算成大氣壓，通過氣壓加壓裝置間斷加力于體外培養(yǎng)的成骨細胞和破骨細胞，其力學參數參考前期實驗。3）、將“生理”負荷和“超”負荷作用于成骨細胞，以1

29、h ,24h ，48 h，4d為取樣點，未加力為對照，抽提mRNA后，逆轉錄標記cDNA ，應用基因芯片技術檢測成骨細胞基因表達譜的時序變化。(取樣時間點系根據前期實驗總結、臨床經驗、及參考相關文獻提出)4）、將“生理”負荷和“超”負荷作用于破骨細胞，以1h ,24h ，48 h，4d 為取樣點，未加力為對照，抽提mRNA后，逆轉錄標記cDNA ，應用基因芯片技術檢測成骨細胞基因表達譜的時序變化。三）、體內骨組織不同負荷和時間下成骨細胞和破骨細胞基因表達譜基因芯片檢測1）、90只SD大鼠動物模型，隨機分為三組，每組各30只。2）、I組：按“生理”負荷力值加載，隨機選5只大鼠，分成6小組，分別在

30、1h加載后，以及24h, 48 h，4d加載（每天3次，每次1小時）后取下大鼠股骨，分別分離種植體和骨組織，取與種植體交界處骨組織，采用激光捕獲顯微分離技術分別分離出成骨細胞和破骨細胞，將每小組5個樣品的成骨細胞（或破骨細胞）等量混合，抽提mRNA，逆轉錄標記cDNA,基因芯片檢測成骨細胞和破骨細胞的基因表達譜（基因芯片為大鼠Oligo基因芯片，6000個cDNA的微陣列，由北京博奧生物芯片有限公司協(xié)助制備）。3）、II組：按“超”負荷力值加載后，隨機選5只大鼠，分成6小組，分別在1h加載后，以及24h，48h,6d加載（每天3次，每次1小時）后取下大鼠股骨，其余方法同I組。4）、III組：無

31、負荷加栽組，與上兩組同期取種植體周圍骨組織，抽提成骨細胞和破骨細胞mRNA，逆轉錄標記cDNA,基因芯片檢測成骨細胞和破骨細胞基因表達譜。四）、采用RT-PCR檢測不同負荷下表達差異明顯的基因擬對在骨形成和骨吸收中基因表達差異（上調或下調）超過5倍的基因，應用RT-PCR法進行基因表達水平的半定量測定，并結合基因數據庫分析此生理過程中涉及功能性基因的種類和變化的幅度，以期闡明“標記”基因。1）、樣品在做基因芯片檢測之前，提取部分細胞，標記，液氮凍存?zhèn)溆谩?）、據基因芯片檢測的結果，對I、II組基因表達差異最大的數個基因通過逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法，抽提細胞的總RNA，逆轉錄，再通

32、過隨機引物法對此類基因進行基因表達水平的半定量分析。結合基因數據庫，分析這些基因的主要功能及作用。五）、統(tǒng)計學分析處理統(tǒng)計學分析各項實驗結果，明確間斷壓力下的骨形成和骨破壞過程中，成骨細胞和破骨細胞特異性基因的表達和時序變化，通過體內外實驗的對比，探討成骨細胞和破骨細胞在間斷力學刺激下的耦聯(lián)機制。 生理負荷 超負荷體外培養(yǎng)的成骨(OB)細胞和破骨細胞(OC)體外培養(yǎng)的成骨細胞(OB)和破骨細胞(OC) 基因芯片 基因芯片 體外OB、OC基因表達譜的時序變化體外OB、OC基因表達譜的時序變化研究骨形成到骨吸收質的變化過程中，OB、OC基因調控機理。1、 RT-PCR法檢測OB、OC表達差異最大的

33、幾個基因；2、 結合基因數據庫，明確“標記”基因及功能。骨界面OB、OC基因表達譜的時序變化骨界面OB、OC基因表達譜的時序變化基因芯片 基因芯片 提取骨界面取材的OB和OC提取骨界面取材的OB和OC激光捕獲激光捕獲體內種植體骨界面區(qū)域的骨組織體內種植體骨界面區(qū)域的骨組織 生理負荷超負荷可行性分析：1、項目是在大量查閱國際最新相關文獻資料，并結合申請者本人相關的前期工作的基礎上，采用了多種學科、多種技術相結合的綜合性研究方法，從而保證了立題的新穎性、科學性和可靠性。2、本項目在技術思想上是課題“？”的延續(xù)和發(fā)展。在前期相關的研究中發(fā)現，在生理范圍內，機械應力的增加導致與成骨相關基因表達（比如轉

34、化生長因子-1、骨形成蛋白-4）的激活或上調，有理由相信可能存在破骨相關基因的滅活或下調（或相對水平的下調）。反之亦然。此二者對比，結合相同條件下體內外基因表達譜的異同，我們預期能篩選出與骨形成、骨破壞以及信息耦聯(lián)密切相關的特異性基因，并可進一步研究其互關系。3、項目申請者多年從事生物力學、分子生物學的相關的研究，在臨床和科研上有著多年的組織和實踐經驗。近年先后承擔省科技攻關計劃市科委基金等科研項目積累了與該項目相關的工作經驗，特別是將力學刺激傳遞到骨系細胞的動物實驗模型的建立，為本項目的完成奠定了基礎。4、與課題相關的基因芯片檢測技術比較成熟，課題組成員有一定的工作經驗和技術，已同生物科技有

35、限公司，生物芯片有限公司達成協(xié)議，基因芯片的制備和相關技術支持可以得到保證。5、激光捕獲顯微分離技術（Laser Capture Microdissection LCM）在軟組織應用以很成熟，課題組成員有在骨松質捕獲細胞的經驗，所需設備已具備。4、本項目的特色與創(chuàng)新之處。1）不僅從體外，還通過動物模型從體內探討力學刺激作用下成骨細胞和破骨細胞上千個基因的動態(tài)表達。2）首次應用基因芯片技術從整個基因組的宏觀水平，探尋不同負荷狀態(tài)下，骨形成和骨破壞的基因調控機制，以及成骨細胞和破骨細胞在其中的作用，及其可能的耦聯(lián)機制。3）在體內實驗中采用激光捕獲顯微分離技術（LCM），從骨組織與人工材料界面捕獲所需的成骨細胞和破骨細胞，使相關基因的檢測更加準確。4）通過本課題的研究可能引出的思考： A）不同類型的應力，不同的作用方式和時間均有可能影響基因的表達，本課題為簡化實驗，突出重點，選用間斷力學刺激作為力的作用形式。根據本課題所測得的特異性基因表達的結果為基礎，針對不同應力形式對骨系細胞基因表達的影響是否存在差異這一尚存爭論的問題，通過進一步的實驗，應用聚類分析等方法，可以給出基因水平的判別。B）、若體內實驗發(fā)現的特異性基因表達是體外細胞水平實驗中沒有出現的，