流式細胞儀培訓(xùn)

1、流式細胞儀原理與應(yīng)用流式細胞儀原理與應(yīng)用陳玉嬋陳玉嬋提提 要要n流式細胞儀簡介流式細胞儀簡介n流式細胞儀工作原理流式細胞儀工作原理n流式實驗流程流式實驗流程n流式細胞術(shù)的應(yīng)用流式細胞術(shù)的應(yīng)用流式細胞術(shù)的發(fā)展史流式細胞術(shù)的發(fā)展史n1930s1950s:1930s1950s:開始出現(xiàn)自動細胞分析技術(shù)（細開始出現(xiàn)自動細胞分析技術(shù)（細胞的計數(shù)，是通過光電儀記錄流過一根毛細管胞的計數(shù)，是通過光電儀記錄流過一根毛細管的細胞的細胞, ,用結(jié)合了熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)用結(jié)合了熒光素的抗體去標記細胞內(nèi)的特定蛋白，應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計的特定蛋白，應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計紅細胞光學(xué)自動計數(shù)器。）紅細胞

2、光學(xué)自動計數(shù)器。） n1960s1960s晚期發(fā)展：熒光檢測細胞計晚期發(fā)展：熒光檢測細胞計 、細胞分選、細胞分選器檢測細胞的熒光信號器檢測細胞的熒光信號 、單克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù) n19731973年，年，BDBD公司與美國斯坦福大學(xué)合作，研制公司與美國斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺商用流式細胞儀開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺商用流式細胞儀FACS FACS I I。什么是流式細胞儀？什么是流式細胞儀？n在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的一種儀器在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的一種儀器n儀器特點：單個細胞通過狹窄激光束，產(chǎn)生能夠反映細胞儀器特點：單個細胞通過狹窄激

3、光束，產(chǎn)生能夠反映細胞大小的信號，激光束激發(fā)不同的熒光素所標記的細胞成分大小的信號，激光束激發(fā)不同的熒光素所標記的細胞成分能發(fā)射出不同的熒光。能發(fā)射出不同的熒光。Injector TipSheath fluid流式細胞儀的檢測對象流式細胞儀的檢測對象藻類細胞藻類細胞染色體染色體血細胞血細胞原生動物細胞原生動物細胞任何存在于懸液中的直徑為任何存在于懸液中的直徑為0.2-50微米微米的粒子或細胞都適用于流式分析的粒子或細胞都適用于流式分析流式細胞儀工作原理示意圖流式細胞儀工作原理示意圖流式的基本組流式的基本組成：成：1.流動室和流動室和 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)2.光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)3.電系統(tǒng)電系統(tǒng)流式細胞

4、儀可提供的信息流式細胞儀可提供的信息n物理信息：通過散射光信號反映物理信息：通過散射光信號反映n相對細胞大小相對細胞大小n相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度n熒光信息：通過熒光強度反映熒光信息：通過熒光強度反映 散射光信號的產(chǎn)生散射光信號的產(chǎn)生n488nm激光產(chǎn)生散射光激光產(chǎn)生散射光1. 散射光信號散射光信號n前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的入射激光的同向同向散射光信號散射光信號 反映細胞相對反映細胞相對大小及其表面積大小及其表面積n側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射激光入射激光90 角角

5、的的散射光信號散射光信號 反映細胞反映細胞粒度及細胞內(nèi)相對復(fù)雜性粒度及細胞內(nèi)相對復(fù)雜性 散射光散射光n散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基散射光能被用來區(qū)分不同細胞群體的基本形態(tài)上的差異本形態(tài)上的差異n通常使用通常使用“散點圖散點圖”來看散射光信號來看散射光信號n散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒散點圖上的一個點就代表一個細胞顆粒的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù) 利用散射光信號對混合細胞分群利用散射光信號對混合細胞分群2. 熒光信號熒光信號n熒光素與特異抗體結(jié)合熒光素與特異抗體結(jié)合n熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強熒光信號越強熒光信號的表示方法熒光信號的表示方法雙參數(shù)

6、點圖雙參數(shù)點圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖一個完整流式實驗的組成一個完整流式實驗的組成n樣品的處理樣品的處理n調(diào)整儀器條件調(diào)整儀器條件n數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理1.樣品處理樣品處理n單細胞懸液的制備單細胞懸液的制備n濃度濃度5 5 10105 5 1 1 10106 6/mL/mLn外周血、骨髓、培養(yǎng)細胞、組織外周血、骨髓、培養(yǎng)細胞、組織( (經(jīng)尼龍網(wǎng)經(jīng)尼龍網(wǎng)300300目目過過濾濾) ) 制成單細胞懸液制成單細胞懸液n選擇合適的熒光染料染色選擇合適的熒光染料染色n必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)必須能夠被流式細胞儀上所配備的激光器所激發(fā)n激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范激發(fā)的光譜必

7、須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)圍內(nèi)n熒光素光譜的重疊應(yīng)當盡量減少熒光素光譜的重疊應(yīng)當盡量減少2.儀器條件的確定儀器條件的確定n電壓電壓n閾值閾值n熒光補償（多色分析）熒光補償（多色分析）n處在液流中的粒子通過激光束時產(chǎn)生光信號，這些處在液流中的粒子通過激光束時產(chǎn)生光信號，這些光信號通過光電探測器轉(zhuǎn)換成電信號（電壓）。調(diào)光信號通過光電探測器轉(zhuǎn)換成電信號（電壓）。調(diào)整電壓，可使信號強度改變。整電壓，可使信號強度改變。nBDBD流式細胞儀有兩種類型的光電探測器：光電二極流式細胞儀有兩種類型的光電探測器：光電二極管和光電倍增管（管和光電倍增管（PMTsPMTs）。）。 nPMTPMT用于檢測較弱

8、的用于檢測較弱的SSCSSC信號和熒光信號信號和熒光信號 ，光電二，光電二極管用于檢測較強的極管用于檢測較強的FSCFSC信號信號 電壓電壓閾值閾值n閾值：閾值：信號放大過程會產(chǎn)生不需要的脈沖信號，通常信號放大過程會產(chǎn)生不需要的脈沖信號，通常來自于碎片。通過設(shè)定某一信號的最低強度值，可將來自于碎片。通過設(shè)定某一信號的最低強度值，可將不需要的脈沖信號去除，這一設(shè)定值稱為閾值。不需要的脈沖信號去除，這一設(shè)定值稱為閾值。熒光補償熒光補償n采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差熒光補償熒光補償補償調(diào)整的實驗過程補償調(diào)整的實驗過程n樣本準備：陰性樣本

9、，單陽性樣本樣本準備：陰性樣本，單陽性樣本n調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有PMT 第二步：單陽性樣本調(diào)整補償?shù)诙剑簡侮栃詷颖菊{(diào)整補償n判斷標準：判斷標準：補償模型補償模型PE-X%FITC補償前補償前補償后補償后FITC單染單染數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析n設(shè)門設(shè)門n設(shè)定陰性與陽性群體的界限設(shè)定陰性與陽性群體的界限n確定陽性與陰性細胞群體確定陽性與陰性細胞群體n統(tǒng)計陽性或陰性細胞群體的百分率，平統(tǒng)計陽性或陰性細胞群體的百分率，平均熒光值，絕對數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)均熒光值，絕對數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)設(shè)門設(shè)門n設(shè)門的意義：選定要分析的目標細胞設(shè)門的意義：選定要分析的目標細胞設(shè)門設(shè)門如何設(shè)定陰

10、性與陽性的界限如何設(shè)定陰性與陽性的界限流式檢測結(jié)果的表示方法流式檢測結(jié)果的表示方法n百分率百分率n絕對計數(shù)絕對計數(shù)n平均熒光強度平均熒光強度n圖形：直方圖、散點圖圖形：直方圖、散點圖流式細胞儀可以告訴我們什么？流式細胞儀可以告訴我們什么？流式細胞術(shù)的細胞學(xué)應(yīng)用流式細胞術(shù)的細胞學(xué)應(yīng)用細胞結(jié)構(gòu)細胞結(jié)構(gòu)n細胞大小細胞大小n細胞流式細胞術(shù)的細細胞流式細胞術(shù)的細胞學(xué)應(yīng)用粒度胞學(xué)應(yīng)用粒度n細胞表面面積細胞表面面積n核漿比例核漿比例nDNADNA含量與細胞周期含量與細胞周期nRNARNA含量含量n蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量n染色體分析染色體分析 細胞功能細胞功能n細胞表面細胞表面/ /胞漿胞漿/ /核的核的特異性

11、抗原特異性抗原n細胞活性細胞活性n細胞內(nèi)細胞因子細胞內(nèi)細胞因子n酶活性酶活性n激素結(jié)合位點激素結(jié)合位點n細胞受體細胞受體n細胞凋亡細胞凋亡流式細胞儀在微生物研究中的應(yīng)用流式細胞儀在微生物研究中的應(yīng)用nDNADNAn蛋白蛋白n過氧化物生成過氧化物生成n胞內(nèi)胞內(nèi)pHpHn鑒別死鑒別死/ /活細菌和酵母菌并計數(shù)活細菌和酵母菌并計數(shù)n區(qū)分革蘭氏陽區(qū)分革蘭氏陽/ /陰性細菌陰性細菌n研究酵母菌細胞器研究酵母菌細胞器n基因表達基因表達- -綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白n病原菌與吞噬細胞的關(guān)系病原菌與吞噬細胞的關(guān)系- -吞噬引起的呼吸爆發(fā)吞噬引起的呼吸爆發(fā)n病毒病毒- -細胞相互作用：病毒感染導(dǎo)致細胞蛋白表達的

12、改細胞相互作用：病毒感染導(dǎo)致細胞蛋白表達的改變，對細胞周期的干擾，對細胞內(nèi)鈣離子水平的影響變，對細胞周期的干擾，對細胞內(nèi)鈣離子水平的影響n病毒引起的凋亡病毒引起的凋亡流式細胞儀的臨床應(yīng)用流式細胞儀的臨床應(yīng)用=HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4絕對計數(shù)絕對計數(shù)=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=腫瘤的細胞周期和倍體分析腫瘤的細胞周期和倍體分析=網(wǎng)織紅細胞計數(shù)網(wǎng)織紅細胞計數(shù)=細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測=干細胞計數(shù)干細胞計數(shù)=殘量白血病細胞檢查殘量白血病細胞檢查=HLA-B27HLA-B27檢查檢查=血小板功能及相關(guān)疾病血小板功能及相關(guān)

13、疾病補償調(diào)整實驗補償調(diào)整實驗藻類細胞絕對計數(shù)藻類細胞絕對計數(shù)細胞周期分析細胞周期分析nDNADNA含量分析含量分析-PI-PI染色染色細胞凋亡細胞凋亡n細胞膜分析細胞膜分析-PS-PS外翻外翻 PSPS（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內(nèi)表（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內(nèi)表面，凋亡時，面，凋亡時，PSPS外翻向細胞外表面。重組蛋白外翻向細胞外表面。重組蛋白Annexin-VAnnexin-V可與可與PSPS結(jié)合結(jié)合細胞凋亡細胞凋亡細胞生理學(xué)研究細胞生理學(xué)研究nCaCa2+2+流動性檢測流動性檢測nCaCa2+2+ 是非常重要的細胞內(nèi)離子，在胞膜到是非常重要的細胞內(nèi)離子，在胞膜到胞漿的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中

14、起重要的作用。細胞受到胞漿的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。細胞受到刺激后，胞內(nèi)刺激后，胞內(nèi)CaCa2+2+濃度會發(fā)生改變。濃度會發(fā)生改變。n最常用的染料最常用的染料nIndo-1 excited at UVnFluo-3 excited at 488nmnFura red excited at 488nm細胞生理學(xué)研究細胞生理學(xué)研究n細胞活性分析細胞活性分析 Fluorescein DiacetateFluorescein Diacetate進入活細胞后進入活細胞后, ,被胞內(nèi)被胞內(nèi)酯酶降解酯酶降解, ,生成熒光底物生成熒光底物. .活細胞會發(fā)綠色熒光活細胞會發(fā)綠色熒光細胞生理學(xué)研究細胞生理學(xué)研究n細胞膜電位的改變細胞膜電位的改變n超極化的細胞攝取更多的染料，細胞總的熒超極化的細胞攝取更多的染料，細胞總的熒光強度增大；細胞去極化時，染料釋放到細光強度增大；細胞去極化時，染料釋放到細胞外，總的熒光強度減少胞外，總的熒光強度減少。n染料和試劑染料和試劑