木聚糖酶活力的測定方法

1、木聚糖酶活力的測定方法1 .木聚糖酶活力單位定義在37C、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中降解釋放lumol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位u。2 .測定原理木聚糖酶能將木聚糖降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中木聚糖酶的活力。3 .試劑與溶液除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的三級水。3.1 乙酸溶液，c（CH3C

2、OOH）為0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸鈉溶液，c（CH3COONa）為0.1mol/L：稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.3 氫氧化鈉溶液，c（NaOH）為200g/L：稱取氫氧化金內(nèi)20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.4 乙酸乙酸鈉緩沖溶液，c（CH3COOHCH3COONa）為0.1mol/L,pH值為5.5:稱取三水乙酸鈉23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。測定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)至5.5。3.5 木糖溶液

3、，c（C5H10O5）為10.0mg/ml：稱取無水木糖1.000g,加緩沖液（3.4）溶解，定容至100ml。3.6 木聚糖溶液：1.0%（w/v）稱取木聚糖（SigmaX0672）1.00g,加入氫氧化鈉0.34g,磁力攪拌再加入60ml水，磁力攪拌至木聚糖完全溶解。再加入冰乙酸0.5ml,再用乙酸溶液（3.1）調(diào)節(jié)pH值至5.5。繼續(xù)攪拌30min,用緩沖液（3.4）定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4c避光保存，有效期為7天。3.7 DNS試劑稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g（化學純），加水500ml,攪拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液（

4、3.4）,同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48C。）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45c水浴加熱，同時補加水300ml,不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000ml。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光彳存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。4 .儀器與設備4.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。4.2 分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH計：精確至0.01。4.5 磁力攪拌器：附加熱功能。4.6

5、電磁振蕩器。4.7 燒結(jié)玻璃過濾器：孔徑為0.45m。4.8 離心機：2000g以上。4.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在3060C之間，精度為0.1C。4.10 秒表：每小時誤差不超過5s。4.11 分光光度計：能檢測350800nm的吸光度范圍。5 .標準曲線的繪制吸取緩沖液（3.4）4.0ml,加入DNS試齊J（3.7）5.0ml,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25.0ml,制成標準空白樣。分別吸取木糖溶液（3.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分別用緩沖液（3.4）定容至100ml,配制成濃度為0.100.70mg/ml木糖

6、標準溶液。分別吸取上述濃度系列的木糖標準溶液各2.00ml（做二個平行），分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml水和5mlDNS試齊J（5.7）。電磁振蕩3s,沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25mlo以標準空白樣為對照調(diào)零，在540nm處測定吸光度OD值。以木糖濃度為丫軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。6 .試樣溶液的制備固體試樣應粉碎或充分碾碎，然后過60目篩（孔徑為0.25mm）。稱取試樣兩份，精確至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.4）。磁力攪拌30min,再用緩沖溶液（3.4）定容至100ml,

7、在4c條件下避光保存24ho搖勻，取出30-50ml,2000g離心3min。吸取5.00ml上清液，再用緩沖溶液（3.4）做二次稀釋（稀釋后的待測酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.040.08U/ml之間）。液體試樣可以直接用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.4）進行稀釋、定容（稀釋后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之間）。如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5,需要用乙酸溶液（3.1）或乙酸鈉溶液（3.2）調(diào)節(jié)至5.5,然后再用緩沖溶液（3.4）做適當定容。7測定步驟吸取10.0ml木聚糖溶液（3.6）,37c平衡10min。吸取10.0ml經(jīng)過適當稀釋的酶液，37c平衡10

8、min。吸取2.00ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入5mlDNS試齊J（3.7）,電磁振蕩3s。然后加入2.0ml木聚糖溶液（3.6）,37c保溫30min,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣（參見5）為空白對照，在540nm處測定吸光度Ab。吸取2.00ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0ml木聚糖（3.6）（已經(jīng)過37c平衡），電磁振蕩3s,37c精確保溫30min。加入5.0mlDNS試劑（3.7）,電磁振蕩3s,以終止酶解反應。沸水浴加熱5min,用自來水冷卻至

9、室溫，加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度Ae。8.試樣酶活力的計算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000MXt式（1）中：Xd一試樣稀釋液的木聚糖酶活力，U/ml;Ae酶反應液的吸光度；Ab酶空白樣的吸光度；K一標準曲線的斜率；Co一標準曲線的截距；M一木糖的分子量（150.2）;t酶解反應時間，min;1000轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000umol。Xd值應在0.040.08u/ml之間。如果不在這個范圍內(nèi)，應重新選擇酶液的稀釋度，再進行分析測定。X=XdDf（2）式（2）中：X一試樣木聚糖酶的活力，u/g;Df一試樣的總稀釋倍數(shù)。酶活力的計

10、算值保留三位有效數(shù)字。9重復性同一樣品兩個平行測定值的相對誤差不超過8.0%,二者的平均值為最終的酶活力測定值（保留三位有效數(shù)字）。（3-葡聚糖酶活力的測定1 .3-葡聚糖酶活力單位定義在37C、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/ml的3-葡聚糖溶液中降解釋放lumol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位uo2 .測定原理3-葡聚糖酶能將3-葡聚糖降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中3-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可

11、以計算反應液中3-葡聚糖酶的活力。3 .試劑與溶液除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的三級水。3.1 葡糖糖溶液，c（C6H12。6）為10.0mg/ml：稱取無水葡萄糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）為0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸鈉溶液，c（CH3COONa）為0.1mol/L：稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氫氧化鈉溶液，c（NaOH）為200g/L：稱取氫氧化金內(nèi)20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸鈉緩沖

12、溶液，c（CH3COOHCH3COONa）為0.1mol/L,pH值為5.5:稱取三水乙酸鈉23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。測定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)至5.5。3.63-葡聚糖溶液：0.8%（w/v）稱取3-葡聚糖（SigmaG6513）0.80g,加入10ml無水乙醇，潤濕2分鐘，再加入50ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至3-葡聚糖完全溶解（注：在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml。）。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min,用乙

13、酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）定容至100ml。3-葡聚糖溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4c避光保存，有效期為3天。冷凍保存，有效期為2個月（使用前在4c條件下解凍）。3.7 DNS試劑稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g（化學純），加水500ml,攪拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液（3.4）,同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48C。）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45c水浴加熱，同時補加水300ml,不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000

14、mlo用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。4 .儀器與設備4.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。4.2 分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH計：精確至0.01。4.5 磁力攪拌器：附加熱功能。4.6 電磁振蕩器。4.7 燒結(jié)玻璃過濾器：孔徑為0.45m。4.8 離心機：2000g以上。4.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在3060C之間，精度為0.1C。4.10 秒表：每小時誤差不超過5s。4.11 分光光度計：能檢測350800nm的吸光度范圍。4.12 移掖器；精度為11。5 .標準曲線

15、的繪制吸取緩沖液（3.5）4.0ml,加入DNS試齊J（3.7）5.0ml,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25.0ml,制成標準空白樣。分別吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分別用緩沖液（3.5）定容至100ml,配制成濃度為0.100.70mg/ml葡萄糖標準溶液。分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標準溶液各2.00ml（做二個平行），分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml水和5mlDNS試齊J（3.7）。電磁振蕩3s,沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25ml。以標準空白樣為對照調(diào)零，在54

16、0nm處測定吸光度OD值。以葡萄糖濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。6 .試樣溶液的制備固體試樣應粉碎或充分碾碎，然后過60目篩（孔徑為0.25mm）。稱取試樣兩份，精確至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）。磁力攪拌30min,再用緩沖溶液（3.5）定容至100ml,在4c條件下避光保存24h。搖勻，取出30-50ml,2000g離心3min。吸取5.00ml上清液，再用緩沖溶液（3.5）做二次稀釋（稀釋后的待測酶液中纖維素酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之間）。液體試樣可以直接用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3

17、.5）進行稀釋、定容（稀釋后的酶液中葡聚糖酶活力最好能控制在0.040.08u/ml之間）。如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5,需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)、校正至5.5,然后再用緩沖溶液（3.5）做適當定容。吸取4.0ml3-葡聚糖溶液（3.6）,37c平衡10min。吸取10.0ml經(jīng)過適當稀釋的酶液，37c平衡10min。吸取2.00ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入5mlDNS試劑（3.7）,電磁振蕩3s。然后加入2.0ml3-葡聚糖溶液（3.6）,40c保溫30min,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml,電

18、磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度Ab。吸取2.0ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0ml葡聚糖溶液（3.6）（已經(jīng)過37c平衡），電磁振蕩3s,37c精確保溫30min。加入5.0mlDNS試齊J（3.7）,電磁振蕩3s,酶解反應。沸水浴加熱5min,用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度Ae。8.試樣酶活力的計算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000（1）MXt式（1）中：Xd試樣稀釋?中的3-葡聚糖酶活力，u/ml;Ae酶反應液的吸光度；Ab酶空白樣的吸光度；

19、K一標準曲線的斜率；Co一標準曲線的截距；M一葡萄糖的分子量（180.2）;t酶解反應時間，min;1000轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000umol。Xd值應在0.040.08u/ml之間。如果不在這個范圍內(nèi)，應重新選擇酶液的稀釋度，再進行分析測定。X=XdDf（2）式（2）中：X一試樣3-葡聚糖酶的活力，u/g；Df一試樣的總稀釋倍數(shù)。酶活力的計算值保留三位有效數(shù)字。9重復性同一樣品兩個平行測定值的相對誤差不超過8.0%,二者的平均值為最終的酶活力測定值（保留三位有效數(shù)字）。纖維素酶活力的測定1 .纖維素酶活力單位定義在37C、pH值為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4mg/ml的竣甲基纖維素鈉

20、溶液中降解釋放lumol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位uo2 .測定原理纖維素酶能將竣甲基纖維素降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中纖維素酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中纖維素酶的活力。3 .試劑與溶液除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的三級水。3.1 葡糖糖溶液，c（C6H12。6）為10.0mg/ml：稱取無水葡萄糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（

21、CH3COOH）為0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸鈉溶液，c（CH3COONa）為0.1mol/L：稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氫氧化鈉溶液，c（NaOH）為200g/L：稱取氫氧化金內(nèi)20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸鈉緩沖溶液，c（CH3COOHCH3COONa）為0.1mol/L,pH值為5.5:稱取三水乙酸鈉23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。測定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)至5.5。3.6竣

22、甲基纖維素鈉溶液：0.8%（w/v）稱取竣甲基纖維素鈉（SigmaC5678）0.80g,加入80ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至竣甲基纖維素鈉完全溶解（注：在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml。）。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min,用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）定容至100ml。竣甲基纖維素鈉溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4c避光保存，有效期為3天。3.7 DNS試劑稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g（化學純），加水500ml,攪拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液（3.4）,同時不斷攪拌，直到溶液

23、清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48C。）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45c水浴加熱，同時補加水300ml,不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000mlo用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。4儀器與設備4.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。4.2 分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH計：精確至0.01。4.5 磁力攪拌器：附加熱功能。4.6 電磁振蕩器。4.7 燒結(jié)玻璃過濾器：

24、孔徑為0.45m。4.8 離心機：2000g以上。4.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在3060C之間，精度為0.1C。4.10 秒表：每小時誤差不超過5s。4.11 分光光度計：能檢測350800nm的吸光度范圍。4.12 移掖器；精度為11。5標準曲線的繪制吸取緩沖液（3.5）4.0ml,加入DNS試齊J（3.7）5.0ml,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25.0ml,制成標準空白樣。分別吸取葡萄糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分別用緩沖液（3.5）定容至100ml,配制成濃度為0.100.70mg/ml葡萄糖標準溶

25、液。分別吸取上述濃度系列的葡萄糖標準溶液各2.00ml（做二個平行），分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml水和5mlDNS試齊J（3.7）。電磁振蕩3s,沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25ml。以標準空白樣為對照調(diào)零，在540nm處測定吸光度OD值。以葡萄糖濃度為丫軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。4.13 液的制備固體試樣應粉碎或充分碾碎，然后過60目篩（孔徑為0.25mm）。稱取試樣兩份，精確至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）。磁力攪拌30min,再用緩沖溶液（3.5）定容至100ml,在4

26、c條件下避光保存24ho搖勻，取出30-50ml,2000g離心3min。吸取5.00ml上清液，再用緩沖溶液（3.5）做二次稀釋（稀釋后的待測酶液中纖維素酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之間）。液體試樣可以直接用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）進行稀釋、定容（稀釋后的酶液中纖維素酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之間）。如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5,需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)、校正至5.5,然后再用緩沖溶液（3.5）做適當定容。7測定步驟吸取10.0ml竣甲基纖維素鈉溶液（3.6）,37c平衡10min。吸取10.0ml經(jīng)過適當稀釋的酶液，37

27、c平衡10min。吸取2.00ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入5mlDNS試齊J（3.7）,電磁振蕩3s。然后加入2.0ml竣甲基纖維素鈉溶液（3.6）,37c保溫30min,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度Ab。吸取2.0ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0ml竣甲基纖維素鈉（3.6）（已經(jīng)過37c平衡），電磁振蕩3s,37c精確保溫30min。加入5.0mlDNS試齊J（3.7）,電磁振蕩3s,酶解反應。沸水浴加熱5min,用自

28、來水冷卻至室溫，加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度Ae。8.試樣酶活力的計算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000（1）MXt式（1）中：Xd一試樣稀釋液中的纖維素酶活力，u/ml;Ae酶反應液的吸光度；Ab酶空白樣的吸光度；K一標準曲線的斜率；Co一標準曲線的截距；M一葡萄糖的分子量（180.2）;t酶解反應時間，min;1000轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000umol。Xd值應在0.040.08u/ml之間。如果不在這個范圍內(nèi)，應重新選擇酶液的稀釋度，再進行分析測定。X=XdDf（2）式（2）中：X一試樣纖維素酶的活力，u/g;Df一試樣的總

29、稀釋倍數(shù)。酶活力的計算值保留三位有效數(shù)字。9重復性同一樣品兩個平行測定值的相對誤差不超過8.0%,二者的平均值為最終的酶活力測定值（保留三位有效數(shù)字）。果膠酶活力的測定1 .酶活定義在pH5.5、37c下，每分鐘內(nèi)從濃度為4mg/ml的底物（Fluka76280或SigmaP9135）溶液中分解釋放1umol還原物質(zhì)（表述為半乳糖醛酸）所需要的酶量為一個酶活單位uo2 .測定原理果膠酶能將聚半乳糖醛酸降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中果膠酶的活力成正比。因此

30、，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中果膠酶的活力。3 .試劑與溶液除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的三級水。3.1 葡糖糖溶液，c（C6H12。6）為10.0mg/ml：稱取無水葡萄糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）為0.1mol/L：吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸鈉溶液，c（CH3COONa）為0.1mol/L：稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氫氧化鈉溶液，c（NaOH）為200g/L：稱取氫氧化金內(nèi)20.0g。加水溶解，定容至1

31、00ml。3.5 乙酸乙酸鈉緩沖溶液，c（CH3COOHCH3COONa）為0.1mol/L,pH值為5.5:稱取三水乙酸鈉23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。測定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5,再用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)至5.5。3.6聚半乳糖醛酸溶液：0.8%（w/v）稱取果膠（SigmaP9135）0.80g,加入80ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至聚半乳糖醛酸完全溶解（注：在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml。）。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min,用乙酸一乙

32、酸鈉緩沖溶液（3.5）定容至100ml。聚半乳糖醛酸溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4c避光保存，有效期為3天。3.7 DNS試劑稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g（化學純），加水500ml,攪拌5s,水浴至45C。然后逐步加入100ml氫氧化鈉溶液（3.4）,同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48C。）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45c水浴加熱，同時補加水300ml,不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000mlo用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光

33、保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。4儀器與設備1.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。1.2 分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。1.3 分析天平：感量0.001g。1.4 pH計：精確至0.01。1.5 磁力攪拌器：附加熱功能。1.6 電磁振蕩器。1.7 燒結(jié)玻璃過濾器：孔徑為0.45m。1.8 離心機：2000g以上。1.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在3060C之間，精度為0.1C。1.10 秒表：每小時誤差不超過5s。1.11 分光光度計：能檢測350800nm的吸光度范圍。1.12 移掖器；精度為11。5 .標準曲線制備標準一水A半乳糖醛酸溶液，一水半乳糖醛酸的濃度范圍應在1

34、10mg/m1之間。用緩沖液溶解1.0克一水半乳糖醛酸，定容至100ml,獲得濃度為10mg/m1的半乳糖醛酸溶液。然后用緩沖液作系列稀釋，配制濃度為0、0.1mg/m1、0.2mg/m1、0.3mg/m1、0.4mg/m1、0.5mg/m1、0.6mg/m1、0.7mg/m1和8.0mg/m1的標準底物溶液。吸取2.0m1標準溶液和2.0m1蒸儲水，加入到試管中。震蕩，加入5m1DNS試劑，震蕩、蒸煮5分鐘。然后在自來水中冷卻。再用蒸儲水定容至25ml。震蕩搖勻，在2000g離心10min,取濾液，以濃度為0的反應液（標準空白樣）作為基準，調(diào)零。在540nm處測定吸光度。測定值做2個重復，取

35、平均值。每次更換DNS試劑，標準曲線需要重新繪制。6 .酶活測定精確稱取1.000克樣品用緩沖液溶解酶樣，稀釋至適當濃度。酶樣吸光度A吸取2.0ml酶稀釋液，加入到試管中，加入2.0ml果膠底物溶液，在40c平衡，震蕩。在40c精確水浴30分鐘。加入5m1DNS試劑，混合。用帽塞蓋住試管。在沸水中精確保溫5分鐘。然后，在冰水中終止反應。再蒸儲水定容至25ml,充分搖勻，在2000g離心10min。取上清液，以標準空白樣為基準，調(diào)零，在540nm處測定吸光度（吸光度在0.150.7之間，如果超過此范圍，重新確定稀釋度。）。測定值做2個重復，取平均值。酶空白樣吸光度Ao吸取2.0ml聚半乳糖醛酸溶

36、液，在37c精確保溫30min。加入5m1DNS試劑，震蕩。加入2.0ml酶的稀釋液，混合。在沸水中精確蒸煮5min。然后用水冷卻，終止反應。用蒸儲水定容至25ml,充分搖勻，然后在2000g離心10min,取上清液。以標準空白樣為基準，調(diào)零，在540nm處測定吸光度。測定值做2個重復，取平均值。7 .酶活計算AxAoXKX1000XDf(u/g)酶活A=WtAx:酶樣的吸光度；Ad：酶空白樣的吸光度；K:標準曲線的斜率；1000:轉(zhuǎn)換因子1mmol=1000umol;D:稀釋倍數(shù)；W一水半乳糖醛酸的分子量（212.16）;t:反應時間（min）。1 .甘露聚糖酶活力單位定義在37C、pH值為

37、5.5的條件下，每分鐘從濃度為3mg/ml的甘露聚糖(SigmaG0753)溶液中降解釋放lumol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位uo2 .測定原理甘露聚糖酶能將甘露聚糖降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應。反應液顏色的強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通過分光比色測定反應液顏色的強度，可以計算反應液中甘露聚糖酶的活力。3 .試劑與溶液除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的三級水。3.1 甘露糖溶液，c(C6H12O6)為10.0mg/ml：

38、稱取無水D-甘露糖1.000g,加水溶解，定容至100ml。3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)為0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。3.3 乙酸鈉溶液，c(CH3COONa)為0.1mol/L：稱取三水乙酸鈉1.36g。加水溶解，定容至100ml。3.4 氫氧化鈉溶液，c(NaOH)為200g/L：稱取氫氧化金內(nèi)20.0g。加水溶解，定容至100ml。3.5 乙酸乙酸鈉緩沖溶液，c(CH3COOHCH3COONa)為0.1mol/L,pH值為5.5:稱取三水乙酸鈉23.14g,加入冰乙酸1.70mlo再加水溶解，定容至2000ml。測定溶液的pH值。如果p

39、H值偏離5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸鈉溶液(3.3)調(diào)節(jié)至5.5。3.6甘露聚糖溶液：0.6%(w/v)稱取甘露聚糖(SigmaG0753)0.60g,加入80ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(3.5)。磁力攪拌，同時緩慢加熱，直至甘露聚糖完全溶解(注：在攪拌加熱的過程中可以補加適量的緩沖液，但是溶液的總體積不能超過100ml。)。然后停止加熱，繼續(xù)攪拌30min,用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液(3.5)定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前適當搖勻。4c避光保存，有效期為3天。3.7 DNS試劑稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g(化學純)，加水500ml,攪拌5s,水浴至45C。然后逐步加

40、入100ml氫氧化鈉溶液(3.4),同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明(注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48C。)。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45c水浴加熱，同時補加水300ml,不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000mlo用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個月。4儀器與設備4.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。4.2 分樣篩：孔徑為0.25mm（60目）。4.3 分析天平：感量0.001g。4.4 pH計：精確至0.01。4.5 磁力攪拌器

41、：附加熱功能。4.6 電磁振蕩器。4.7 燒結(jié)玻璃過濾器：孔徑為0.45m。4.8 離心機：2000g以上。4.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在3060C之間，精度為0.1C。4.10 秒表：每小時誤差不超過5s。4.11 分光光度計：能檢測350800nm的吸光度范圍。4.12 移掖器；精度為11。5標準曲線的繪制吸取緩沖液（3.5）4.0ml,加入DNS試齊J（3.7）5.0ml,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，用水定容至25.0ml,制成標準空白樣。分別吸取甘露糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分別用緩沖液（3.5）定容至10

42、0ml,配制成濃度為0.100.70mg/mlD-甘露糖標準溶液。分別吸取上述濃度系列的甘露糖標準溶液各2.00ml（做二個平行），分別加入到刻度試管中，再分別加入2ml水和5mlDNS試齊J（3.7）。電磁振蕩3s,沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25ml。以標準空白樣為對照調(diào)零，在540nm處測定吸光度OD值。以甘露糖濃度為丫軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。6試樣溶液的制備固體試樣應粉碎或充分碾碎，然后過60目篩（孔徑為0.25mm）。稱取試樣兩份，精確至0.001g。加入50ml乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）。磁力

43、攪拌30min,再用緩沖溶液（3.5）定容至100ml,在4c條件下避光保存24ho搖勻，取出30-50ml,2000g離心3min。吸取5.00ml上清液，再用緩沖溶液（3.5）做二次稀釋（稀釋后的待測酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之間）。液體試樣可以直接用乙酸一乙酸鈉緩沖溶液（3.5）進行稀釋、定容（稀釋后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.040.08u/ml之間）。如果稀釋后酶液的pH值偏離5.5,需要用乙酸溶液（3.2）或乙酸鈉溶液（3.3）調(diào)節(jié)、校正至5.5,然后再用緩沖溶液（3.5）做適當定容。7測定步驟吸取10.0ml經(jīng)過適當稀釋的酶液，37c平衡

44、10min。吸取2.00ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入5mlDNS試劑（3.7）,電磁振蕩3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6）,37c保溫30min,沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度Ab。吸取2.0ml經(jīng)過適當稀釋的酶液（已經(jīng)過37c平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液（3.6）（已經(jīng)過37c平衡），電磁振蕩3s,37c精確保溫30min。加入5.0mlDNS試齊J（3.7）,電磁振蕩3s,酶解反應。沸水浴加熱5min,用自來水冷卻至室溫，

45、加水定容至25ml,電磁振蕩3s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度Ae。8.試樣酶活力的計算（Ae-Ab）XK+CoXd=X1000（1）MXt式（1）中：Xd一試樣稀釋液中的甘露糖聚酶活力，u/ml;Ae酶反應液的吸光度；Ab酶空白樣的吸光度；K一標準曲線的斜率；Co一標準曲線的截距；M一甘露糖的分子量（180.2）;t酶解反應時間，min;1000轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000umol。Xd值應在0.040.08u/ml之間。如果不在這個范圍內(nèi)，應重新選擇酶液的稀釋度，再進行分析測定。X=XdDf（2）式（2）中：X一試樣甘露聚糖酶的活力，u/g;Df一試樣的總稀釋倍數(shù)。酶

46、活力的計算值保留三位有效數(shù)字。9重復性同一樣品兩個平行測定值的相對誤差不超過8.0%,二者的平均值為最終的酶活力測定值（保留三位有效數(shù)字）。1 .酶活定義在37C、pH3.0條件下，每分鐘從濃度為1.0%的酪蛋白溶液中降解釋放1微克酪氨酸所需要的酶量為一個酶活單位Uo2 .測定原理蛋白酶在一定溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。在堿性條件下，含有酚基的氨基酸可以將福林試劑還原，生成鋁藍和鴇藍。用分光光度計測定反應液的顏色強度，對照標準曲線計算酪氨酸的產(chǎn)生量和酶活力。3 .配制副林試劑在2000ml磨口回流裝置中加入鴇酸鈉（Na2WO4-2H2O）100g、鋁酸鈉（Na2MoO42H2O）25g,水700ml、85%的磷酸50ml、濃鹽酸100ml,小心沸騰回流10h。再取下回流冷凝器，在通風櫥中加入硫酸鋰（Li2SO4）50g、水50ml和數(shù)滴濃濱水（99.0%）,沸騰15min,以除去多余的澳。如冷卻后仍有綠色，需要再加濱水，再煮沸除去過量的澳。冷卻，加水定容到1000mlo制得的試劑應呈黃色，存儲在棕色瓶內(nèi)。使用時加2倍的蒸儲水稀釋。4 .繪制標準曲線稱取干燥無水的酪氨酸0.1000g,用0.1mol/L的鹽酸溶液