基因工程基礎(chǔ)知識(shí)

1、第一章 基因工程第一節(jié) 基因工程概述一基因工程的概念操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程結(jié)果生物體外基因分子水平剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)人類需要的基因產(chǎn)物由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行操作,因此又叫做重組DNA技術(shù)。二基因工程的基本工具（一）“分子手術(shù)刀”限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）1來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。2功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。3結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。 （二）“分子針線”DNA連接酶1分類：根據(jù)酶的來源不同，可分為E·coliDNA

2、連接酶和T4DNA連接酶兩類2功能：恢復(fù)被限制酶切開了的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。兩種DNA連接酶(E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶)的比較：相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵區(qū)別：EcoIiDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能使黏性末端之間連接；T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低。DNA連接酶與DNA聚合酶作用的比較DNA連接酶DNA聚合酶不同點(diǎn)連接的DNA雙鏈單鏈模板不要模板要模板連接的對(duì)象2個(gè)DNA片段單個(gè)脫氧核苷酸加到已存在的單鏈DNA片段上相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)形成磷酸二酯鍵化學(xué)本質(zhì)蛋白質(zhì)(三)“分子運(yùn)輸車”載體1.載體具備的條件：能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存

3、；具有一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段插入；具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。2.基因工程常用的載體有：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)、植物病毒等。最早應(yīng)用的載體是質(zhì)粒，它是細(xì)菌細(xì)胞中的一種很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。三基因工程的基本過程(一) 獲得目的基因（目的基因的獲?。?.獲取方法主要有兩種：從自然界中已有的物種中分離出來，如可從基因文庫中獲取。用人工的方法合成。獲得原核細(xì)胞的目的基因可采取直接分離，獲取真核細(xì)胞的目的基因一般是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）PCR的含義：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。（2

4、）目的：獲取大量的目的基因（3）原理：DNA雙鏈復(fù)制（4）過程：第一步：加熱至9095DNA解鏈為單鏈；第二步：冷卻到5560，引物與兩條單鏈DNA結(jié)合；第三步：加熱至7075，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。（5）特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增(二)制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）1重組DNA分子的組成：除了目的基因外，還必須有標(biāo)記基因。標(biāo)記基因的作用：鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。2方法：同種限制酶分別切割載體和目的基因，再用DNA連接酶把兩者連接。(三)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）1.轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體

5、細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。2.常用的轉(zhuǎn)化方法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)（農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法），其次還有基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)（基因槍法）和花粉管通道技術(shù)（花粉管通道法）。將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是受精卵。將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：Ca處理法。(四) 篩選出獲得目的基因的受體細(xì)胞、培養(yǎng)受體細(xì)胞并誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)（目的基因的檢測(cè)與鑒定）1.首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。2.其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。3.最后檢測(cè)目的基因是否翻譯

6、成蛋白質(zhì)，方法是采用抗原抗體雜交技術(shù)。4.有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如抗蟲或抗病的鑒定等。第二節(jié)基因工程的應(yīng)用1運(yùn)用基因工程改良動(dòng)植物品種最突出的優(yōu)點(diǎn)是：能打破常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限。2基因工程的應(yīng)用（1）植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。（2）動(dòng)物基因工程：提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度來提高產(chǎn)品產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體等。（3）基因診斷和基因治療：基因診斷：又稱為DNA診斷，是采用基因檢測(cè)的方法來判斷患者是否出現(xiàn)了基因異?；驍y帶病原體?；蛑委煟褐咐谜；蛑脫Q或彌補(bǔ)缺陷基因的治療方法。實(shí)例：ADA基因缺

7、陷癥的基因治療第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程1蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)：根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，通過改造基因，以定向改造天然蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造自然界不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)。2蛋白質(zhì)工程的基本原理預(yù)期蛋白質(zhì)功能測(cè)定蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列找到對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）具有預(yù)期功能的蛋白質(zhì)3.蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用（1）通過改造酶的結(jié)構(gòu)，有目的地提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。（2）合成嵌合抗體。（3）改變蛋白質(zhì)的活性。蛋白質(zhì)工程與基因工程區(qū)別蛋白質(zhì)工程基因工程實(shí)質(zhì)通過改造基因，以定向改造天然蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)將目的基因從供體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果合成自然界不存在的蛋

8、白質(zhì)只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)聯(lián)系蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上，延伸出的第二代基因工程細(xì)胞工程（一）植物細(xì)胞工程 1.理論基礎(chǔ)（原理）：細(xì)胞全能性全能性表達(dá)的難易程度：受精卵生殖細(xì)胞干細(xì)胞體細(xì)胞；植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞2.植物組織培養(yǎng)技術(shù)（1）過程：離體的植物器官、組織或細(xì)胞 愈傷組織 試管苗 植物體（2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。（3）地位：是培育轉(zhuǎn)基因植物、植物體細(xì)胞雜交培育植物新品種的最后一道工序。3.植物細(xì)胞培養(yǎng)（蘇教版）（1）概念：在實(shí)驗(yàn)室工廠化生產(chǎn)的條件下，將組織培養(yǎng)過程中形成的愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，得

9、到分散游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量的細(xì)胞群體的一種技術(shù)。（2）與植物組織培養(yǎng)的關(guān)系植物組織培養(yǎng)是基礎(chǔ)。目的不同：植物組織培養(yǎng)的目的是得到更多的植物體，植物細(xì)胞培養(yǎng)的目 的是獲得人類所需的細(xì)胞（3）實(shí)例：成功地培養(yǎng)紅豆杉的細(xì)胞，從中提取出重要的抗腫瘤藥物紫杉醇。4.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)（1）過程：（2）誘導(dǎo)融合的方法：物理法包括離心、振動(dòng)、電刺激等。化學(xué)法一般是用聚乙二醇（PEG）作為誘導(dǎo)劑。（3）意義：克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙。（二）動(dòng)物細(xì)胞工程 1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（1）概念：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些

10、細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖。（2）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的流程：取動(dòng)物組織塊（動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的器官或組織）剪碎用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)貼滿瓶壁的細(xì)胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。（3）細(xì)胞貼壁和接觸抑制：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。細(xì)胞數(shù)目不斷增多，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互抑制時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要滿足以下條件無菌、無毒的環(huán)境：培養(yǎng)液應(yīng)進(jìn)行無菌處理。通常還要在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素，以防培養(yǎng)過程中的污染。此外，應(yīng)定期更換培養(yǎng)液，防止代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞

11、自身造成危害。營(yíng)養(yǎng)：合成培養(yǎng)基成分：糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。溫度：適宜溫度：哺乳動(dòng)物多是36.50.5；pH：7.27.4。氣體環(huán)境：95%空氣5%CO2。O2是細(xì)胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。（5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測(cè)有毒物質(zhì)、培養(yǎng)醫(yī)學(xué)研究的各種細(xì)胞。2.動(dòng)物組織培養(yǎng)（蘇教版）： 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物組織培養(yǎng)方法類似，主要區(qū)別是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要用胰蛋白酶等使組織塊中的細(xì)胞離散，而動(dòng)物組織培養(yǎng)過程中不需要使用胰蛋白酶等。3.動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物（1）哺乳動(dòng)物核移植可以分

12、為胚胎細(xì)胞核移植（比較容易）和體細(xì)胞核移植（比較難）。（2）選用去核卵(母)細(xì)胞的原因：卵(母)細(xì)胞比較大，容易操作；卵(母)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)多，營(yíng)養(yǎng)豐富。（3）體細(xì)胞核移植的大致過程是：核移植胚胎移植（4）體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用：加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)良畜群繁育；保護(hù)瀕危物種，增大存活數(shù)量；生產(chǎn)珍貴的醫(yī)用蛋白；作為異種移植的供體；用于組織器官的移植等。（5）體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題：克隆動(dòng)物存在著健康問題、表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷等。4.動(dòng)物細(xì)胞融合（1）動(dòng)物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。融合后形成的具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。（

13、2）動(dòng)物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同，誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法類似，常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。（3）動(dòng)物細(xì)胞融合的意義：克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物生物新品種培育的重要手段。（4）動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交的比較：比較項(xiàng)目細(xì)胞融合的原理細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)手段用法植物體細(xì)胞雜交細(xì)胞膜的流動(dòng)性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合離心、電刺激、振動(dòng)，聚乙二醇等試劑誘導(dǎo)克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，獲得雜種植株動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞膜的流動(dòng)性使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合除應(yīng)用植物細(xì)胞雜交手段外，再加滅活的病毒誘導(dǎo)制備單克隆抗體的技術(shù)之一5.單克隆抗體（1）抗體：一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差。（2）單克隆抗體的制備過程：注入小鼠細(xì)胞融合分離抗原注入小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞雜交