第三章基因工程目的基因的獲取分離

1、第三章第三章 基因工程目的基因基因工程目的基因的獲取分離的獲取分離 直接從染色體直接從染色體DNA中分離中分離 人工化學(xué)合成人工化學(xué)合成 通過通過mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 從基因文庫中分離從基因文庫中分離 PCR擴(kuò)增特定的基因片段擴(kuò)增特定的基因片段一一 化學(xué)合成法化學(xué)合成法1 基因片段的全化學(xué)合成基因片段的全化學(xué)合成 2 基因片段的化學(xué)基因片段的化學(xué)-酶促合成酶促合成二二 基因的酶促合成（逆轉(zhuǎn)錄法）基因的酶促合成（逆轉(zhuǎn)錄法）mRNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶圖圖1 基因的化學(xué)合成及克隆基因的化學(xué)合成及克隆圖圖2 基因的化學(xué)基因的化學(xué)-酶促合成酶促合成基因組文庫：基因組文庫：指某一生物

2、的全部基因的集合。指某一生物的全部基因的集合。 基因組文庫：基因組文庫：指用全基因組指用全基因組DNA，通過幾種限制性內(nèi)切酶切，通過幾種限制性內(nèi)切酶切 割，所產(chǎn)生的基因組割，所產(chǎn)生的基因組DNA片段與載體重組并克片段與載體重組并克 隆，由此產(chǎn)生的克隆群體包含了基因組隆，由此產(chǎn)生的克隆群體包含了基因組DNA的的 所有序列，稱基因組文庫。所有序列，稱基因組文庫。 基因組文庫的大小的估算：基因組文庫的大小的估算：N=ln（1P）/ln（1 f）N：為基因組文庫必需的克隆數(shù)目。：為基因組文庫必需的克隆數(shù)目。P：為文庫中含目的基因：為文庫中含目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率。片段的出現(xiàn)概率。f：是插入片段的

3、大小與全基因組大小的比值。：是插入片段的大小與全基因組大小的比值。（一）基因組文庫的建立（一）基因組文庫的建立基因組文庫應(yīng)具有的克隆子數(shù)基因組文庫應(yīng)具有的克隆子數(shù)基因組大小基因組大小/bp2106（細(xì)菌）（細(xì)菌） 2107 （真菌）（真菌） 2109（動(dòng)物）（動(dòng)物）理論克隆數(shù)理論克隆數(shù) 實(shí)際克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù) 理論克隆數(shù)理論克隆數(shù) 實(shí)際克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù) 理論克隆數(shù)理論克隆數(shù) 實(shí)際克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù) 克隆片段平克隆片段平均大小均大?。╞p）5103 400 1831 4000 18 418 600 000 2 763 11010103 200 919 2000 9208 300 000 1 381

4、55020103 100 458 1000 4603 150 000 690 77440103 50 278 500 2300 75 000 345 386 總總RNAmRNAtRNArRNAcDNA文庫：文庫：指用一種生物的指用一種生物的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ) DNA所建立的文庫。所建立的文庫。 （1）隨機(jī)引物引導(dǎo)法）隨機(jī)引物引導(dǎo)法（2）oligo（dT）引導(dǎo)法）引導(dǎo)法 1 mRNA分離分離 cDNA 文庫的構(gòu)建共分四步文庫的構(gòu)建共分四步 第一：細(xì)胞總第一：細(xì)胞總 RNA 的提取和的提取和 mRNA 分離；分離；第二：第一鏈第二：第一鏈 cDNA 合成；合成；第三：第二

5、鏈第三：第二鏈 cDNA 合成；合成；第四：雙鏈第四：雙鏈 cDNA 克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體 并導(dǎo)入宿主中繁殖。并導(dǎo)入宿主中繁殖。 （1）隨機(jī)引物引導(dǎo)法）隨機(jī)引物引導(dǎo)法（2）oligo（dT）引導(dǎo)法）引導(dǎo)法 35 5 mRNAmRNA35 逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶3cDNA第一條鏈第一條鏈dNTP35 mRNAAAAAAAT T T T T T35 AAAAAAT T T T T TKlenow酶酶mRNAcDNA第一條鏈第一條鏈dNTP3 第二條鏈的合成第二條鏈的合成（1）自身引導(dǎo)法）自身引導(dǎo)法用氫氧化鈉消化雜合雙鏈用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的中的 mRNA 鏈鏈

6、 解離的第一鏈解離的第一鏈 cDNA 的的 3-末端就會(huì)形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)末端就會(huì)形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈 cDNA 合成時(shí)的特性，原因合成時(shí)的特性，原因至今未知，據(jù)推測(cè)可能是至今未知，據(jù)推測(cè)可能是由帽子的特殊結(jié)構(gòu)相關(guān)）由帽子的特殊結(jié)構(gòu)相關(guān)）引導(dǎo)引導(dǎo) DNA 聚合酶復(fù)制出第聚合酶復(fù)制出第二鏈，此時(shí)形成的雙鏈之二鏈，此時(shí)形成的雙鏈之間是連接在一起的間是連接在一起的再利用再利用 S1 核酸酶將連接處核酸酶將連接處（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行連接。行連接。 cDNA 第二鏈合成的方法有四種，自身引導(dǎo)第二鏈

7、合成的方法有四種，自身引導(dǎo)合成法，置換合成法，引導(dǎo)合成法和引物合成法，置換合成法，引導(dǎo)合成法和引物銜接頭合成法。銜接頭合成法。 缺缺 點(diǎn)點(diǎn): 在以在以S1核酸酶切割核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí),會(huì)導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于致對(duì)應(yīng)于mRNA 5端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排. S1核酸酶的純度不夠時(shí)核酸酶的純度不夠時(shí),會(huì)偶爾破壞合成的雙鏈會(huì)偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子分子 （2）雙鏈）雙鏈cDNA的置換合成的置換合成它是由一組酶共同控制，包它是由一組酶共同控制，包括括 RNA 酶酶 H 、大腸桿菌、大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 和和 DNA 連接連接酶。酶。

8、mRNAcDNA 雜合雙鏈中的雜合雙鏈中的 mRNA 鏈在鏈在 RNA 酶酶 H 作用下作用下先形成很多切口，先形成很多切口， mRNA 鏈鏈就被切割成很多的小片段，這就被切割成很多的小片段，這些小片段為大腸桿菌些小片段為大腸桿菌 DNA 聚聚合酶合酶 提供了合成第二鏈的提供了合成第二鏈的引物。引物。 大腸桿菌大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 以第一以第一鏈鏈 cDNA 為模板合成一段段互補(bǔ)的為模板合成一段段互補(bǔ)的 cDNA 片段。這些片段。這些 cDNA 片段進(jìn)而片段進(jìn)而在在 DNA 連接酶的作用下連接成一連接酶的作用下連接成一條鏈，即條鏈，即 cDNA 的第二鏈的第二鏈 遺留在遺留在 5-末

9、端的一段很小的末端的一段很小的 mRNA 也被大腸桿也被大腸桿菌菌 DNA 聚合酶聚合酶 的的 5-3 核酸外切酶和核酸外切酶和 RNA 酶酶 H 降解，暴露出與第一鏈降解，暴露出與第一鏈 cDNA 對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)的 3-端部分端部分序列。同時(shí)，大腸桿菌序列。同時(shí)，大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 的的 3-5 核酸外切酶的活性可將暴露出的第一鏈核酸外切酶的活性可將暴露出的第一鏈 cDNA 的的 3-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。這端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。這種方法合成的種方法合成的 cDNA 在在 5-端存在幾個(gè)核苷酸缺失，端存在幾個(gè)核苷酸缺失，但一般不影響編碼區(qū)的完整。但一般

10、不影響編碼區(qū)的完整。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):a)合成合成cDNA的效率高的效率高 b)直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化 c)避免使用避免使用S1核酸酶來切割雙鏈核酸酶來切割雙鏈cDNA （3）引物引物-銜接頭法雙鏈銜接頭法雙鏈DNADNA的合成的合成 Gubler 和和 Hoffman（1983）通過改進(jìn)引導(dǎo)合成法而來的）通過改進(jìn)引導(dǎo)合成法而來的 第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈 cDNA 的的 3-端端加上一段加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的 Poly（dG）短核苷酸鏈

11、作引物合成互補(bǔ)的）短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的 cDNA 鏈，接頭鏈，接頭序列可以是適用于序列可以是適用于 PCR 擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成酶切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成 PCR 法構(gòu)建法構(gòu)建 cDNA 文庫的常用方法。文庫的常用方法。 4 引導(dǎo)合成法引導(dǎo)合成法本方法是本方法是 Okayama 和和 Berg 1982 提出提出的。首先是制備一端帶有的。首先是制備一端帶有 Poly（dG）的片段的片段 和帶有和帶有 Poly（dT）的載體）的載體片段片段 ，并用片段，并用片段 來代替來代替 Oligo（dT）進(jìn)行）

12、進(jìn)行 cDNA 第一鏈的合成，在第一鏈的合成，在第一鏈第一鏈 cDNA 合成后直接采用末端轉(zhuǎn)合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（移酶（TdT）在第一鏈）在第一鏈 cDNA 的的 3-端端加上一段加上一段 Poly（dC）的尾巴，同時(shí)進(jìn)）的尾巴，同時(shí)進(jìn)行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段 一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在合雙鏈在 RNA 酶酶 H 、大腸桿菌、大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 和和 DNA 連接酶的作用下合連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈 cDNA 。其主要特點(diǎn)是合成全長其主要特點(diǎn)是合成全長 cD

13、NA 的比例的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的較高，但操作比較復(fù)雜，形成的 cDNA 克隆中都帶有一段克隆中都帶有一段 Poly（dC）/（dA），對(duì)重組子的復(fù)制和測(cè)序都不），對(duì)重組子的復(fù)制和測(cè)序都不利。利。查閱資料自學(xué)！查閱資料自學(xué)！如何找回兩端缺少的序如何找回兩端缺少的序列？列？1核酸探針的來源核酸探針的來源 根據(jù)根據(jù)DNAmRNA蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的“中心法則中心法則” 2 寡核苷酸探針的人工合成寡核苷酸探針的人工合成 氨基端氨基端MetProGluGly羧基端。其中羧基端。其中Met只有只有AUG一個(gè)密一個(gè)密碼子，碼子，Pro有有4 個(gè)可能的密碼子，個(gè)可能的密碼子，Glu也有也有4 個(gè)可能

14、的密碼子，個(gè)可能的密碼子，Gly有有2個(gè)可能的密碼子。這些密碼子經(jīng)隨機(jī)排列，可能出現(xiàn)個(gè)可能的密碼子。這些密碼子經(jīng)隨機(jī)排列，可能出現(xiàn)144232種可能的組合。種可能的組合。 （三）在（三）在cDNA文庫中分離基因文庫中分離基因當(dāng)把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸當(dāng)把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜之后，就可以同特異性纖維素濾膜之后，就可以同特異性的核酸探針進(jìn)行菌落或噬菌班雜交，的核酸探針進(jìn)行菌落或噬菌班雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克以便篩選出具有目的基因的陽性克隆。這個(gè)過程叫做克隆基因的分離隆。這個(gè)過程叫做克隆基因的分離或篩選或篩選 應(yīng)用核酸探針分離目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。此法的最

15、大優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用核酸探針分離目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。此法的最大優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用廣泛，而且相當(dāng)有效，尤其適用于大量群體的篩選是應(yīng)用廣泛，而且相當(dāng)有效，尤其適用于大量群體的篩選 自然界中有一些蛋白質(zhì)的核苷酸編碼序列，在其進(jìn)化的過程中保持著高度的保守性，自然界中有一些蛋白質(zhì)的核苷酸編碼序列，在其進(jìn)化的過程中保持著高度的保守性，這樣就使核酸的種間雜交成為可能。已知組蛋白在因、肌動(dòng)蛋白基因及這樣就使核酸的種間雜交成為可能。已知組蛋白在因、肌動(dòng)蛋白基因及-神經(jīng)生長神經(jīng)生長因子（因子（-nerve hrowth factor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA

16、探針，并已成功地用于分離相關(guān)的基因。探針，并已成功地用于分離相關(guān)的基因。在同一蛋白質(zhì)家族內(nèi)，也存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段，即所謂的保守區(qū)。在同一蛋白質(zhì)家族內(nèi)，也存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段，即所謂的保守區(qū)。這些保守區(qū)往往是由彼此相鄰的這些保守區(qū)往往是由彼此相鄰的6-7個(gè)氨基酸組成，這樣的長度適合于推導(dǎo)合成寡個(gè)氨基酸組成，這樣的長度適合于推導(dǎo)合成寡核苷酸探針庫，用來分離編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的核苷酸探針庫，用來分離編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的cDNA。 知道待分離的目的基因的蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物，而對(duì)其核苷酸序列卻一無所知知道待分離的目的基因的蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物，而對(duì)其核苷酸序列卻一無所知的情況下，可以按照測(cè)定的蛋白質(zhì)

17、氨基酸序列資料，設(shè)計(jì)合成寡核酸探針的情況下，可以按照測(cè)定的蛋白質(zhì)氨基酸序列資料，設(shè)計(jì)合成寡核酸探針以資使用以資使用 A 應(yīng)用核酸探針分離克隆的目的基因應(yīng)用核酸探針分離克隆的目的基因 mRNA差別顯示技術(shù)也叫差別顯示技術(shù)也叫DDRT-PCR（differential display RT-PCR），即差異顯示），即差異顯示RT-PCR。 在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的不同基在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的不同基因按時(shí)間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方式，叫做基因的差別表達(dá)因按時(shí)間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方式，叫做基因的差別表達(dá)（differential exp

18、ression），生物的發(fā)育與分化、細(xì)胞的周期變化、生物），生物的發(fā)育與分化、細(xì)胞的周期變化、生物體對(duì)外界環(huán)境壓力反應(yīng)，以及個(gè)體的衰老與死亡等所有的生命過程，都體對(duì)外界環(huán)境壓力反應(yīng)，以及個(gè)體的衰老與死亡等所有的生命過程，都可歸結(jié)于基因的差別表達(dá)。可歸結(jié)于基因的差別表達(dá)。 理想的顯示技術(shù)應(yīng)具備：理想的顯示技術(shù)應(yīng)具備：1 重復(fù)性好；重復(fù)性好；2 便于分離與鑒定便于分離與鑒定原理：合成原理：合成2組引物，通過隨機(jī)組合使組引物，通過隨機(jī)組合使15000種種mRNA都有都有3端的端的poly(A)尾，而在尾，而在poly(A)前面的前面的2個(gè)堿基只有倒數(shù)第二位可以為個(gè)堿基只有倒數(shù)第二位可以為A，故有，故

19、有12種組合的特點(diǎn)，把其中的種組合的特點(diǎn)，把其中的3端端引物設(shè)計(jì)成引物設(shè)計(jì)成T12MN，所以共有，所以共有12種分別對(duì)總種分別對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而把進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而把mRNA分成分成12等等份，每份將獲取份，每份將獲取1/12的的cDNA亞群。然后用一個(gè)亞群。然后用一個(gè)5端的隨機(jī)引物對(duì)這個(gè)端的隨機(jī)引物對(duì)這個(gè)cDNA亞群進(jìn)行亞群進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到能在測(cè)序膠上分辨的條帶，可區(qū)分的分子大小在擴(kuò)增，得到能在測(cè)序膠上分辨的條帶，可區(qū)分的分子大小在500bp以內(nèi)，在以內(nèi)，在PCR反應(yīng)時(shí)加入同位素標(biāo)記的反應(yīng)時(shí)加入同位素標(biāo)記的dATP，電泳后對(duì)，電泳后對(duì)X線片曝光，就可以發(fā)現(xiàn)一對(duì)細(xì)胞群體中有線片曝光，

20、就可以發(fā)現(xiàn)一對(duì)細(xì)胞群體中有差異的差異的cDNA片段，這就是。片段，這就是。mRNA差異顯示存在的問題差異顯示存在的問題1 檢測(cè)全部的檢測(cè)全部的mRNA工作量大工作量大2 如何提高稀有如何提高稀有mRNA的檢測(cè)水平的檢測(cè)水平3 如何盡量減少假陽性如何盡量減少假陽性4 不能進(jìn)行定量研究不能進(jìn)行定量研究要獲得要獲得mRNA的全部片段，必須有的全部片段，必須有20個(gè)個(gè)10個(gè)堿基長度的隨機(jī)引物和個(gè)堿基長度的隨機(jī)引物和12個(gè)固定引物，有個(gè)固定引物，有240種組合種組合引物片段過短，再擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)率低引物片段過短，再擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)率低非相關(guān)非相關(guān)cDNA污染污染因擴(kuò)增片段短，特別是小于因擴(kuò)增片段短，特別是小于200bp的的cDNA，Northern雜交檢測(cè)無信號(hào)或雜交檢測(cè)無信號(hào)或有信號(hào)無差異有信號(hào)無差異PCR高度敏感，擴(kuò)增出一些稀有的高度敏感，擴(kuò)增出一些稀有的mRNA片段片段差異差異PCR擴(kuò)增的是擴(kuò)增的是poly(A)末端區(qū)，這些區(qū)域有些是不翻譯的或是重復(fù)的，末端區(qū)，這些區(qū)域有些是不翻譯的或是重復(fù)的，因而得不到特異的基因因而得不到特異的基因D 應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法分