小鼠氣、血、陰、陽、虛等八種模型四診的比較和評(píng)價(jià)

1、上海市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目,項(xiàng)目編號(hào):2004J003A 通訊作者:方肇勤 T :021-*小鼠氣、血、陰、陽、虛等八種模型四診的比較和評(píng)價(jià)盧文麗 方肇勤 潘志強(qiáng) 付曉伶(上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中醫(yī)學(xué)教研室,上海 201203摘要:為了觀察常見小鼠虛證模型四診表現(xiàn)的異同,及其模型的可靠性,我們依據(jù)文獻(xiàn),分別制作了氣血陰陽各兩種共8個(gè)虛證模型,通過同步檢測(cè)體重、飲水、攝食、肛溫、尾溫、心率及爪、尾顯微放大拍照及圖像處理得到r 值,對(duì)各虛證各模型四診進(jìn)行比較。初步研究表明,在氣虛方面,環(huán)膦酰胺模型屬脾陽氣虛,可能還伴隨血虛和腎虛;番瀉葉模型大體為腹瀉傷津模型,而脾氣虛不是主要的;在血虛方面,乙酰苯肼模型為血

2、虛模型;而尾靜脈放血至血虛模型,需要延長造模時(shí)間、增加放血的次數(shù)和數(shù)量;在陰虛方面,甲狀腺素模型屬陽熱偏盛,陰虛不突出;氫化可的松陰虛模型,接近于陰虛;在陽虛方面,丙基硫氧嘧啶陽虛模型可能要求造模劑量增大和時(shí)間延長;而氫化可的松陽虛模型不甚典型。關(guān)鍵詞:氣虛;血虛;陰虛;陽虛;動(dòng)物模型;小鼠在以往的研究中,虛證的報(bào)道是最多和最集中的,其中還初步涉及到小鼠四診客觀化的研究,證實(shí)小鼠有證可辨1-3。但以往的文獻(xiàn)報(bào)道更多是單獨(dú)就單一證型或單一模型進(jìn)行研究,缺少多模型多證型的同步比較,模型的可靠性也缺乏驗(yàn)證與評(píng)估,給證侯和辨證論治的基礎(chǔ)研究提出了新的要求。因此,為能更好的評(píng)價(jià)常見虛證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,找出

3、相對(duì)穩(wěn)定、敏感的檢測(cè)指標(biāo),推動(dòng)小鼠四診客觀化工作的進(jìn)一步開展,我們進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。1 材料和方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明小鼠,18-20g ,雄性,90只,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):scxk(滬:2003-0003。完全隨機(jī)分為9組。1.2儀器與設(shè)備MP200B 型電子天平,XD-7100單道心電圖機(jī),自制小鼠心電采集裝置,數(shù)字WMY-01型溫度計(jì),SQF-EA 體視顯微鏡,3200K (色溫500W 攝像專用光源,自制光源裝置,NIKON Coolpix4500數(shù)碼相機(jī),Photoshop7.0圖像軟件。1.3造模方法在歸納整理以往的文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上,氣血陰陽四虛證各選

4、取兩種模型,具體如下表: 證型 造模和處理方法 模型起 止時(shí)間出處正常組 不作任何處理環(huán)瞵酰胺氣虛 環(huán)瞵酰胺注射液1mg/10g ,腹腔注射,第1、2天各一次10-14 4 番瀉葉氣虛 番瀉葉水煎劑0.25g/10g ,灌胃,一天一次,8天8-14 5-6 乙酰苯肼血虛 乙酰苯肼6mg/只,皮下注射,第1、4天各一次10-14 8 尾靜脈放血血虛 多次尾靜脈放血,第1、3、5天各一次10-14 9 甲狀腺素陰虛 甲狀腺素混懸液3 mg /10g 灌胃,一天一次,7天8-14 10 氫化可的松陰虛 氫化可的松注射液1mg/10g ,皮下注射, 一天一次,4天 10-14 11丙基硫氧嘧啶陽虛 丙

5、基硫氧嘧啶混懸液0.6mg/10g 灌胃,一天一次,14天1-14 12 氫化可的松陽虛 氫化可的松注射液0.25mg/10g 腹腔注射,一天一次,7天 8-14 13 實(shí)驗(yàn)共21天:依據(jù)造模長短時(shí)間不同,造模起始時(shí)間不相一致,但保證第14天全部造模結(jié)束,第15-21天為造模結(jié)束后(模型形成后的統(tǒng)一觀察時(shí)間。期間共檢測(cè)六次,分別為第1、8、10、15、18、21日。1.4檢測(cè)指標(biāo)一般指標(biāo):體重、飲水、攝食、肛溫、尾溫、爪和尾顯微放大拍照和圖像處理后的r 值。 1.5 檢測(cè)方法第一步:采用Photoshop7.0圖像軟件進(jìn)行圖像處理,選取爪的掌部及尾部作為RGB 色度的定量分析。作為國際標(biāo)準(zhǔn)色的

6、定量,R 代表紅色,G 代表綠色,B 代表藍(lán)色,得到原始爪尾 RGB 14。第二步:校正不同檢測(cè)批次間可能存在的采集條件誤差。將第1批正常組小鼠爪R 的平均值,記為RN1,第2次正常組小鼠爪R 的平均值,記為RN2;RN2/ RN1得到一系數(shù),以此系數(shù)校正第2批各小鼠。其它各批次每只小鼠依次以RN1分別校正處理。第三步:校正隨機(jī)分組后客觀存在的不同組別個(gè)體的差異。取第1批90只小鼠檢測(cè)到的爪R 值的平均數(shù),記為RT ,同時(shí)計(jì)算出第1批9個(gè)組各自爪R 平均值記為R1,R2R9,分別求出RT/ R1,RT/R2RT/R9等9個(gè)校正系數(shù),在以上第二步校正的基礎(chǔ)上,分別以這初始的9個(gè)校正系數(shù)分別校正各

7、自對(duì)應(yīng)組別內(nèi)以后各次檢測(cè)所得的小鼠數(shù)據(jù)(各組第二步校正后的數(shù)值均除以各組對(duì)應(yīng)的校正系數(shù)。第四步:爪G 、B ,尾R 、G 、B 以次類推,得出校正后的爪尾RGB 值。第五步:將校正后的RGB 值帶入公式BG R Rr +=得出校正后的r 值。1.6數(shù)據(jù)處理方法除飲水?dāng)z食外,其它均采用方差分析,方差不齊采用非參檢驗(yàn)。2 結(jié)果與評(píng)價(jià)2.1環(huán)磷酰胺與番瀉葉氣虛模型 圖1不同氣虛造模對(duì)體重的影響 圖2不同氣虛造模對(duì)肛溫的影響 圖3不同氣虛造模對(duì)飲水量的影響圖4不同氣虛造模對(duì)攝食量的影響 圖5不同氣虛造模對(duì)爪r值的影響圖6不同氣虛造模對(duì)尾r值的影響環(huán)膦酰胺造模后動(dòng)物表現(xiàn)為皮毛蓬松,易于捕捉,攝食量、肛溫

8、下降。爪、尾反映紅色程度的r值下降,且持續(xù)時(shí)間長。提示有明顯的氣虛與陽虛,臟腑定位主要在脾,是脾氣虛、脾陽虛。至于爪色淡,爪、尾r值下降,可能部分屬血虛所為;此外,以往藥理實(shí)驗(yàn)提示有骨髓抑制,是否還與腎虛有關(guān),有待進(jìn)一步驗(yàn)證。番瀉葉模型造模后動(dòng)物自主活動(dòng)減少,易于捕捉。造模后約1小時(shí),即出現(xiàn)腹瀉,肛周有污物。但是,動(dòng)物造模后飲水增多;且爪、尾反映紅色程度的r值均上升,不似通常脾氣虛出現(xiàn)爪色淡、飲水減少的表現(xiàn)。肛溫下降原因可能有二:一是番瀉葉藥性偏寒,二是大量腹瀉,因此,具有外來寒邪致病的特點(diǎn),再鑒于其恢復(fù)快,也不似遺傳、體質(zhì)或慢性疾病脾氣虛、脾陽虛的表現(xiàn),最多也就是一過性的傷陽。而且,小鼠對(duì)番

9、瀉葉造模的適應(yīng)性強(qiáng),耐受性形成快。綜合這樣的表現(xiàn),可以推測(cè),采用本實(shí)驗(yàn)方法,番瀉葉所造成的模型大體為腹瀉傷津模型,脾氣虛不是主要的。因此,作為脾氣虛模型,采用番瀉葉短期造模的價(jià)值不大。2.2乙酰苯肼與尾靜脈放血血虛模型 圖7 不同血虛造模對(duì)體重的影響圖8 不同血虛造模對(duì)肛溫的影響 圖9 不同血虛造模對(duì)飲水量的影響圖10 不同血虛造模對(duì)攝食量的影響 圖11 不同血虛造模對(duì)爪r值的影響圖12 不同血虛造模對(duì)尾r值的影響乙酰苯肼模型,動(dòng)物外觀十分虛弱,嗜臥,扎堆明顯(畏寒,肛溫下降,體重與飲水、攝食均下降;爪色明顯改變,爪色淡,爪、尾反映紅色程度的r值下降。造模結(jié)束后動(dòng)物逐漸出現(xiàn)死亡,推測(cè)為劑量偏大

10、所致。肉眼所見爪色伴有一定程度的青紫,是小鼠爪色淡的特殊表現(xiàn),還是血虛同時(shí)伴有血瘀,值得進(jìn)一步研究。聯(lián)系到以往我們觀察到乙酰苯肼造血虛模型小鼠紅血球顯著破壞,因此,乙酰苯肼所造的模型可以肯定地講為血虛模型。至于嗜臥、扎堆(畏寒,肛溫下降,體重、飲水、攝食下降,爪色淡而青紫等一派陽氣虛的表現(xiàn),可能是大量血細(xì)胞破壞和乙酰苯肼大劑量的中毒“氣不附血”的表現(xiàn),需要進(jìn)一步的觀察。連續(xù)5天、共計(jì)3次的放血,難以造成小鼠典型的血虛模型,雖然模型小鼠肛溫有下降趨勢(shì),典型的反映血虛的爪、尾未見明顯的色澤改變,爪r值有下降趨勢(shì),尾r值則相反?？傊?結(jié)合小鼠肛溫、爪、尾等改變,這樣的造模力度,小鼠尚處于有效代償階段

11、,而體質(zhì)的下降已初見端倪。因此,適當(dāng)延長造模時(shí)間、增加放血的次數(shù)和數(shù)量,可能會(huì)成為比較好的模擬失血性血虛模型。從造模的角度看,乙酰苯肼模型造模方便、時(shí)間短,變化明顯而肯定,易于觀察,易于捕捉規(guī)律,是一個(gè)比較理想的血虛模型。2.3甲狀腺素和氫化可的松陰虛模型 圖13 不同陰虛造模對(duì)體重的影響圖14 不同陰虛造模對(duì)肛溫的影響 圖15不同陰虛造模對(duì)飲水量的影響圖16不同陰虛造模對(duì)攝食量的影響 圖17 不同陰虛造模對(duì)爪r值的影響圖18不同陰虛造模對(duì)尾r值的影響甲狀腺素模型造模后動(dòng)物活動(dòng)度增加,有輕微的躁動(dòng);飲水量上升明顯,肛溫有升高趨勢(shì);但是體重卻未見下降、攝食量增加,爪、尾色澤未見明顯變化,甚至反映

12、紅色程度的爪、尾r值還出現(xiàn)下降。綜合以上表現(xiàn),這樣的造模所形成的不是陰虛模型,而是陽熱偏盛,火不旺(紅色的表現(xiàn)闕如的模型。延長造模時(shí)間,可能會(huì)見到類似于臨床的甲亢陰虛模型。氫化可的松造模后,動(dòng)物飲水?dāng)z食略有上升,體重下降,爪、尾反映紅色程度的r值上升,有類似于陰虛的表現(xiàn)。但是,動(dòng)物外在行為表現(xiàn)與正常組比較未見明顯差異,而且肛溫有下降的趨勢(shì),用陰虛難以解釋?？傊灸Ｐ褪且粋€(gè)比較接近陰虛的模型。相比之下,本實(shí)驗(yàn)所造的兩個(gè)模型,均不是十分典型。就造模時(shí)間看,氫化可的松造模時(shí)間短,要方便一些。同時(shí)發(fā)展其他穩(wěn)定、方便的陰虛動(dòng)物模型應(yīng)該是今后的方向之一。2.4丙基硫氧嘧啶與氫化可的松陽虛模型 圖19 不同

13、陽虛造模對(duì)體重的影響圖20 不同陽虛造模對(duì)肛溫的影響血模型比較麻煩，小鼠的代償能力強(qiáng)。短期甲狀腺素模型只能是陽盛模型，并非陰虛；氫化可的 松劑量的偏差可以導(dǎo)致不同的證型。丙基硫氧嘧啶模型推測(cè)需要較長的造模時(shí)間。而在我們前期 的文獻(xiàn)調(diào)查中15-18，這些模型的評(píng)價(jià)還是比較好的。因此，中醫(yī)虛證證侯動(dòng)物模型的摸索和建立， 還有很多工作要做。 在四診檢測(cè)指標(biāo)方面，爪、尾圖像指標(biāo) r 值和飲水、攝食及體重的變化比較穩(wěn)定，而尾溫和 心率次之。就檢測(cè)指標(biāo)的靈敏性而言，爪較尾為靈敏。 在我們以往的研究中，通過顯微照片肉眼識(shí)別和圖象處理相結(jié)合的判別，發(fā)現(xiàn) R 的相對(duì)值 r （即 R 與 R、G、B 總和的百分比

14、）能夠比較客觀地反應(yīng)小鼠爪色的紅的程度，r 值越大，爪色越 紅，r 值越小，爪色越淡19-23，在本次實(shí)驗(yàn)血虛模型中再次得到了驗(yàn)證。 中醫(yī)藥基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，要求符合中醫(yī)的理論與實(shí)踐，我們采用四診合參，以及同步比較不同虛證 造模的異同，達(dá)到了預(yù)期目的，結(jié)論也相對(duì)可靠。遵循這種思路與方法，希望能更準(zhǔn)確地建立和 評(píng)價(jià)不同證侯的動(dòng)物模型，給辨證論治基礎(chǔ)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 參 考 文 獻(xiàn) 方肇勤.中醫(yī)基礎(chǔ)證的一原三維研究J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2002,22(4: 250-251. 方肇勤. 開拓證研究新途徑的思考J.上海中醫(yī)藥雜志, 2001, (4: 4-5. 陳曉,陳德溯,方肇勤. 荷瘤小鼠非創(chuàng)傷性

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