米帕明對(duì)谷氨酸損傷中樞神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

1、米帕明對(duì)谷氨酸損傷中樞神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用(1)                               作者：許勇 姬汴生 石樂鳴 劉紅 張貴卿  【關(guān)鍵詞】  米帕     【摘要】    目的 

2、0;  研究米帕明(Imi)對(duì)谷氨酸損傷培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。方法    分離培養(yǎng)15胎齡的大鼠神經(jīng)細(xì)胞，加入谷氨酸(Glu)，觀察谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用及米帕明的保護(hù)作用。結(jié)果    加入谷氨酸后，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷性變化，死亡率升高，培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)含量增加，細(xì)胞勻漿中丙二醛(MDA)生成增加，超氧化物歧化酶(SOD)含量明顯減少。Imi能不同程度地減輕上述損傷性變化。結(jié)論    I對(duì)谷氨酸所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與鈣拮

3、抗作用有關(guān)。     【關(guān)鍵詞】    米帕明；谷氨酸；大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)     【bstract】    Objective    To study the protective effects of imipramine (Imi) on glutamate-induced neurotoxicity in cultured rat cerebral cortical neurons.ethods   

4、 Cortical neurons of fetal of rat were cultured in vitro.The protective effects of Imi  on glutamate-induced neurotoxicity were  obserced.esults    Exposure of rat fetus cerebral cells to Glu medium developed a neurotoxicity expressed in the increase of LDH leakage and NO,MD

5、A content and the decrease of activity of SOD,as well as the development of morphological injury.Imi protected neurons against above damage significantly.onclusion    The results suggest that Imi prevents the toxicity of Glu.And it maybe attribute to its effect of anticalcium.  &

6、#160;  【ey words】    imipramine,glutamate,cerebral cortical neurons,cell culture     缺血性腦血管病是臨床常見疾病，對(duì)其發(fā)病機(jī)制人們提出了多種學(xué)說(shuō)，如鈣超載學(xué)說(shuō)、興奮毒性學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)等，其中興奮毒性學(xué)說(shuō)早已為人們所重視。谷氨酸(glutamate,Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸，而幾乎所有的神經(jīng)細(xì)胞都有谷氨酸受體，因此任何引起胞外谷氨酸濃度異常增高的病理變化均會(huì)產(chǎn)生興奮毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，米帕明(，）具有鈣拮抗作用，對(duì)兔基底

7、動(dòng)脈有選擇性舒張作用，因此考慮該藥可能有腦保護(hù)作用。本研究利用培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞，建立谷氨酸損傷模型，觀察谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用及研究I是否具有保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。         材料與方法         材料    Wistar大鼠，孕15，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鹽酸米帕明、多聚-賴氨酸(相對(duì)分子量為150 000 ）、谷氨酸、噻唑蘭（MTT)均為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清均為Gibco

8、公司產(chǎn)品；鹽酸阿糖胞苷為上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)990901；乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均為南京建成生物工程研究產(chǎn)品；總蛋白試劑盒為北京中生生物工程高技術(shù)公司產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純。HERA cell二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)GmbH公司)；SW-型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BH-型倒置顯微鏡(日本Olympus Optical公司)；722型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(華東電子管廠)。         方法 

9、0;       胚胎大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)：孕15 istar大鼠腹腔注射水合氯醛350麻醉，無(wú)菌條件下剖腹取出胎鼠，開顱取出大腦皮層放入預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中，剔除軟腦膜和血管，將腦組織移入含血清的DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和10%馬血清)的小燒杯中，用細(xì)口吸管反復(fù)輕輕吹打成細(xì)胞懸液，以200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，并將濾液細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×個(gè)，接種于經(jīng)0.01%多聚-賴氨酸過(guò)夜處理的細(xì)胞培養(yǎng)板中(24孔板接種1孔，96孔板接種0.1孔)，置37、CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日待細(xì)胞貼壁后換液1次并去除死細(xì)胞，以后每3 d換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)

10、至第6天時(shí)，加入終濃度10阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，18后換新的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。         Glu對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，：取培養(yǎng)12的神經(jīng)細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)液，用無(wú)arlie液(-）：aCl 143，l .，.，.，葡萄糖5.6，.，.洗2遍，每孔加入含Glu終濃度5×的無(wú)Marlie液1(24孔板)、.（孔板)，15后用DMEM培養(yǎng)基洗去Glu,再換用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，置37、培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24。正常對(duì)照組不加G，其余處理同上。給藥組在損傷處理前24及處理過(guò)程中均加入不同濃度的I。  

11、60;      MTT微量自動(dòng)比色：lu損傷細(xì)胞后24，用MTT染色法測(cè)定細(xì)胞存活率。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于終止培養(yǎng)前每孔加入10 （終濃度為0.5L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）100溶解甲肷結(jié)晶，待其充分溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)其OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)為570。細(xì)胞存活率(%)=值/對(duì)照組OD值×100%。         LDH和NO的測(cè)定：細(xì)胞經(jīng)損傷處理后，收集培養(yǎng)上清液，按文獻(xiàn)方法，參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定培養(yǎng)液中LDH活性、NO含量。   &

12、#160;     神經(jīng)細(xì)胞SOD和MDA的測(cè)定：細(xì)胞經(jīng)損傷處理后，去除原培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1LPBS和.( .），再加入50 1%Triton-100，將24孔培養(yǎng)板置振蕩器振蕩1 使細(xì)胞溶解，加入100H3PO4以沉淀蛋白，100 000×于4離心1，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定SOD活力和MDA含量。蛋白質(zhì)定量用雙縮脲法。     表1    米帕明對(duì)Glu引起的神經(jīng)（略）     表2    米帕明對(duì)Glu損傷

13、神經(jīng)細(xì)胞（略）         討論     Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸，在維持神經(jīng)細(xì)胞正常信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用。但Glu大量釋放，激活G受體，繼而引起一系列病理反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。研究表明，腦缺血時(shí)細(xì)胞膜通透性增高，G釋放增加、攝取減少，G濃度升高，過(guò)量G作用于NMDA受體使之門控的離子通道開放，引起K大量外流，C、內(nèi)流，胞內(nèi)鈣超載。細(xì)胞內(nèi)C濃度升高是神經(jīng)元損傷的機(jī)制之一，其后果是多方面的，除可激活一系列C依賴性酶，包括蛋白激酶C(PKC)、一氧化氮合酶(NOS)、核酸內(nèi)切

14、酶(endonuclease)、磷脂酶A2(PLA2)等，觸發(fā)花生四烯酸代謝瀑布、黃嘌呤氧化酶系活化產(chǎn)生自由基，造成細(xì)胞損害外，尚可由激活NOS引起NO的繼發(fā)性損傷。神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在谷氨酸胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate/cystine transporter,又稱Xc antiporter system)，其作用是將胞內(nèi)Clu轉(zhuǎn)運(yùn)出胞，同時(shí)將胱氨酸胞外轉(zhuǎn)運(yùn)入胞。胱氨酸在胞內(nèi)還原為半胱氨酸(Cys)，后者是谷胱甘肽(GSH)的合成原料，也是其合成的限速因素。當(dāng)細(xì)胞外Glu過(guò)多時(shí)可抑制谷氨酸胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，使胱氨酸入胞減少，GSH合成減少。GSH是腦內(nèi)重要的活性氧清除劑，故胞

15、外Glu過(guò)多使細(xì)胞內(nèi)氧自由基(OFR)堆積，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。OFR可以抑制Glu載體的功能，加劇胞外Glu堆積，增強(qiáng)Glu的毒性作用，使活性氧成分更趨增多，形成惡性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞受到Glu損傷后，細(xì)胞死亡率、LDH漏出率升高，NO和膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA生成增多，SOD活性下降。Imi能減少NO、生成，降低LDH漏出率和細(xì)胞死亡率，提高SOD活性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的腦保護(hù)作用。神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷與C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常導(dǎo)致胞內(nèi)C濃度升高密切相關(guān)，細(xì)胞C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是神經(jīng)細(xì)胞變性的“最后共同通道”。興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用總是伴隨著鈣超載現(xiàn)象。因此我們認(rèn)為I對(duì)Glu引起的大鼠

16、神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其鈣拮抗作用有關(guān)。     參    考    文    獻(xiàn)     宋秀媛，可君，張貴卿，等米帕明對(duì)兔離體基底動(dòng)脈的作用中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1992，（）：     Dildy J,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Cain dissociated brain cellsBrain Re

17、s,1999,499：     oh JY,Goldberg MP,Hartley DM,et al.Non- receptor mediated neurotoxicity in cortical culture Neurosci,1993,13(5):496     amura Y,Sato Y,Yokota T,et al.If enprodil prevents glutamate cytotoxicity via polyamine modulatory sites of N-spartate receptors in cu

18、ltued cortical neurons Pharmacol Exp Ther,1993，265(2):1017     孫東旭，張莉，陳學(xué)清體外細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒試驗(yàn)見：朱立平，陳學(xué)清主編免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法北京：人民軍醫(yī)出版社，2000     olh JY,Choi DW.Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in culture by lactate dehydrogenase efflux assayJ Neurosci Med,1987，5(5):83     eller JN,Kindy MS,Holtsberg FW,et al.Mitochondrial manganese superoxide dismutase prevents neural apoptosis and reduces ischemic brain injury:suppression of peroxynitrite production,lipid peroxidation,and mitochondrial dysfunctionNeurosci,1998，18(2):687 &