水稻轉基因試驗方法與步驟

1、水稻轉基因一、實驗目的1 .學習水稻組織培養(yǎng)的方法2 .學習水稻轉基因的方法二、實驗原理5cmHI(14454),GFP目的基因克隆到雙元載體中，雙元載體轉入農桿菌，然后攜帶雙元載體的農桿菌侵染水稻愈傷組織，通過T-DNA插入，把我們的目的基因整合到水稻染色體上。歷史：農桿菌感染受傷的植物產生冠瘤瘤病，發(fā)現是由Ti質粒引起，同時做雜交，發(fā)現只有T-DNA（transferredDNA）這一部分被整合到植物染色體上了。三、試驗步驟：一、水稻愈傷組織的誘導（一）以水稻幼胚為試材誘導愈傷組織1 .消毒：取水稻未成熟種子（灌漿期），按以下步驟消毒：1）用自來水沖洗種子，去掉浮起的癟谷；2）將種子放入2

2、50ml無菌燒杯中（種子數量約占1/3體積），用200ml70%酒精消毒2分鐘；（在操凈工作臺上進行無菌操作）3）加入250ml25%次氯酸鈉（NaClO）溶液，同時加數滴吐溫-20,浸泡90分鐘；4）倒去NaClO溶液，用無菌蒸儲水清洗種子4-5遍。2 .誘導與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無菌操作）1）用鐐子夾住種子，在無菌濾紙上用鋼鉤擠出幼胚，置入誘導培養(yǎng)基中；2）操作完畢后封好培養(yǎng)皿（一般保鮮膜），在暗處適溫下（25-28C）培養(yǎng)5天;3）繼代培養(yǎng)。用鐐子剝下胚性愈傷組織（去掉芽及膜狀物），置入繼代培養(yǎng)基中（凸起面向上），暗處適溫下（25-28C）培養(yǎng)3天。（二）以水稻成熟胚為試材誘導愈傷組織

3、1 .消毒：取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子，按以下步驟消毒：1）將種子放入100ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒2分鐘；2）倒去酒精，加入100ml20%次氯酸鈉（NaClO）溶液，浸泡30分鐘；3）倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸儲水清洗種子4-5遍，最后一遍浸泡30分鐘。2 .誘導與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無菌操作）1）種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導培養(yǎng)基中，每皿1214顆；2）操作完畢用封口膜（MicroporeTMSurgicalTape）封好培養(yǎng)皿，在28c光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3周；3）在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鐐子挑取自然分裂的胚性愈傷組織（淡黃色，致密

4、呈球狀），置入繼代培養(yǎng)基中，在28c光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周。（如不馬上用，需轉移至暗處，于22c繼續(xù)培養(yǎng)1周）1、 農桿菌培養(yǎng)挑取農桿菌單克隆或吸取所保藏的農桿菌菌液100M于4mlYEP（含50mg/lKan和50mg/lStr）培養(yǎng)液中，28C,250rpm振蕩培養(yǎng)20-36h至菌液OD600為0.8-1.0。2、 共培養(yǎng)和抗性愈傷組織的選擇1 .感菌與共培養(yǎng)：1）取培養(yǎng)好的菌液500M于1.5ml離心管中，4C,4000rmp,離心2min,去上清。用含200umol/lAs的30mlAAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD600的終濃度為0.01;2）將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入

5、農桿菌懸浮液侵染5分鐘；3）將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；4）將愈傷組織置于共培上。25c暗培養(yǎng)2.5天。2 .選擇：1）將愈傷組織取出，用無菌水清洗5-6次，其間需不停的振蕩。再用含500mg/l頭抱拉定（或頭抱曝的鈉）的無菌水清洗12遍。最后置于無菌濾紙上瀝干2小時；2）將晾干的愈傷轉入含500mg/l頭抱拉定（或頭抱曝的鈉）和50mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進行第一輪選擇，28C,光照培養(yǎng)14天；3）將長有抗性愈傷的初始愈傷轉到含500mg/l頭抱拉定（或頭抱曝的鈉）和50mg/l潮霉素的培養(yǎng)基上進彳T第二輪選擇，28C,光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。3、

6、 抗性愈傷組織的預分化（可選）將新長出的抗性愈傷組織轉入預分化培養(yǎng)基中，25C,光照培養(yǎng)7天。4、 抗性愈傷組織的誘導分化和生根挑取從同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或塑料廣口瓶中（每皿或每瓶放置5-7顆），用封口膜封好，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗（15-30天）。待苗長至1cm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗注：以上一至五的操作步驟皆在無菌條件下進行。5、 轉基因苗的鍛煉和移栽轉基因苗從分化到移栽最短時間為兩個月左右。將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出（苗長至試管頂部，就要及時開蓋），打開封口膜，加入適量蒸儲水或無菌水（防止培養(yǎng)基長菌），煉苗3天至一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長，檢測。四、注意事項1,超凈臺在用之前要紫外滅菌半個小事，使用前用酒精噴壺噴灑酒精，再用棉球擦干凈臺面2,水稻轉基因對