大腸桿菌電擊轉(zhuǎn)化流程

1、大腸桿菌感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)化流程1.細(xì)菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備準(zhǔn)備：50mL離心管3個10%甘油200mL滅菌蒸儲水100mL冰盒（50mL離心管預(yù)冷）2個1）由-80C冰箱保存的菌種劃單菌落，過夜培養(yǎng)16-20h。晚上將新鮮的菌落接種于裝有20mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37c振蕩培養(yǎng)過夜（約12h）,轉(zhuǎn)速控制在200rpm;2）第二天，取過夜培養(yǎng)物以1%接種量（可適當(dāng)加大）轉(zhuǎn)接入2個含50mLLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37c劇烈振蕩（200rpm）培養(yǎng)至OD600約為0.50.6;3）將2瓶細(xì)菌培養(yǎng)物分別倒入兩個預(yù)冷的50mL離心管，然后至于冰水混合物中驟冷，二定要驟冷,冰水混

2、合物中冷卻至少15min（需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時）3）將離心管于4C,4000rpm,離心10min,收集菌體，棄上清；4）用50ml滅菌蒸儲水（預(yù)冷至4C）輕輕重懸菌體，先加入少量水重懸菌體，然后把水加滿，4,4000rpm離心10min,棄上清，再重復(fù)一次；5）再用10%甘油重復(fù)步驟4）兩次，4000rpm離心10min,最后一次倒盡上清后，再用殘存管底的甘油懸浮細(xì)胞，分裝ep管，1005/支（一般，25mL起始培養(yǎng)物最終用200-250此l0%甘油懸?。?）放入-80C冰箱中速凍。或者立即用于電轉(zhuǎn)化。注意：1）菌種最好是-80C凍存的，活化后生長狀態(tài)較好。2）20ml培養(yǎng)

3、過夜，振蕩速度不要過高（一般應(yīng)該是37C,300rpm,6h,當(dāng)天轉(zhuǎn)接，這樣一天內(nèi)工作量太大，這里我們選擇過夜培養(yǎng)，時間長，轉(zhuǎn)速控制在200rpm,可以適當(dāng)縮短時間，前一天晚接種，第二天早轉(zhuǎn)接）3）培養(yǎng)完畢后一定要驟冷，是培養(yǎng)物在短時間內(nèi)迅速冷卻。冰水混合物中搖動瓶子，大約15min。4）使用的器皿一點要非常干凈，沒有化學(xué)物質(zhì)殘存，可以先用餐洗凈洗，再加入NaOH固體和蒸儲水產(chǎn)熱，最后用蒸儲水反復(fù)沖洗干凈。注意pH值檢測5）培養(yǎng)完畢后的離心操作一定要低溫，所用的水和甘油，離心管都要冰上預(yù)冷。6）整個過程盡量不要用槍吹打。7）器皿和試劑最好最后用重蒸水涮洗和配置。8）控制好菌體的OD600值，收

4、菌以半對數(shù)期合適，一般OD為0.50.6最佳，過則不佳。9）最后一次務(wù)必倒盡上清后，用殘存管底的甘油懸浮細(xì)胞，一般每管僅剩200人左右。切勿用過多甘油也懸浮細(xì)胞，我曾用350-50010%的甘油/25mL出發(fā)菌液，導(dǎo)致細(xì)胞濃度下降，電轉(zhuǎn)效率低2-3個數(shù)量級。2電轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備：冰盒、1.5mL離心管、電擊杯、37c的LB培養(yǎng)基1）將電擊杯冰上預(yù)冷，凍存的感受態(tài)細(xì)胞取出冰上溶解2）在冰上，305感受態(tài)細(xì)胞加入1人純化的連接液（或者加入0.3-0.5未純化的連接液），冰上培育5min;3）將混合液加入預(yù)冷的電擊杯（不要產(chǎn)生氣泡），冰浴10min;4）然后電擊（注意擦干杯外的水，防止電火花）,電擊條件為2

5、.5KV,200歐姆，25uF（我們用的是BioRad電轉(zhuǎn)化儀，0.2電轉(zhuǎn)化杯），時間常數(shù)應(yīng)該在4.5-5ms之間（其值越大，說明感受態(tài)細(xì)胞中離子去除率越徹底。）電擊（將電擊杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲）。（Dopowt專利：klebisella200歐姆，2.5kv4-5ms,0.2電擊杯，405細(xì)胞+12此DNA）5）迅速加入1mL37C保溫的LB（電轉(zhuǎn)完成后加入無抗性培養(yǎng)基的速度很重要，一般不能超過一分鐘,否則效率大大降低），將混合液吸出，轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中（此步有熱擊的作用，室溫進(jìn)行）6） 37C,220-250rpm振蕩培養(yǎng)1h,可適當(dāng)延長時間，使其充分表達(dá)

6、抗性7）涂板注意：1 ）電擊之前保持低溫狀態(tài)2）連接液要純化，去離子，ddH2O溶，或者加入0.3-0.5人未純化的連接液，切勿過多以免電火花，我曾經(jīng)使用過0.3人和0.6山連接液的加入細(xì)胞做對比，轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)3）原核生物受體細(xì)胞電擊以15kw/cm場強為最佳，電擊電壓根據(jù)電擊杯厚度選擇4）電擊杯使用完，用針頭蒸儲水反復(fù)沖洗杯底，再用70%乙醇浸泡，4c存放，使用前烘干即可，或者烘干后，-20C冰箱存放5）37c振蕩培養(yǎng)時間切勿過長，否則會有很多的衛(wèi)星菌落和輕微的菌膜干擾。我曾培養(yǎng)1h45min即出現(xiàn)上述衛(wèi)星菌落和輕微的菌膜干擾電擊杯的清洗流程清洗方法一：1 .用清水將電擊杯稍沖一下2 .向電擊杯中加入75%的酒精浸泡2h3 .棄去酒精，在用蒸儲水沖洗2-3遍，然后用1mL的槍吸取超純水反復(fù)吹打電擊杯10遍以上4 .加入無水乙醇2mL于電擊杯中浸泡30分鐘5 .棄去無水乙醇，于通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)干乙醇6 .將清洗好的電擊杯放入-20C冰箱內(nèi)待用7 .不同樣品使用的電擊杯應(yīng)分開；每周用1%酒精浸泡30分鐘。清洗方法二：1、第一次使用完后，立即對著自來水沖洗幾次，然后放在泡有洗衣粉的瓶子里泡幾個小時；2、然后用牙簽裹住一薄層棉花深入到夾層里