淀粉酶固定化實驗方案

1、實驗三、-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測一、實驗背景：酶：生物體內(nèi)活細胞產(chǎn)生的具有催化作用的有機物。 在21世紀，酶已經(jīng)大規(guī)模地應(yīng)用于食品、化工、輕紡、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域： ·果汁制作（果膠酶分解細胞壁，促進果汁生成。） ·加酶洗衣粉（某些酶對污漬的作用一般堿性物質(zhì)更大） ·根據(jù)體內(nèi)酶活性變化檢測疾?。ǖ矸勖傅幕钚源笮】审w現(xiàn)胰臟、腎臟的功能） 固定化酶：將水溶性酶用物理或化學的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。直接使用酶缺點固定化酶優(yōu)點通常對強酸、強堿、高溫和有機溶劑等條件非常敏感，容易失活固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，可較長時間地儲存和使用；

2、（更能耐受溫度、PH的變化）溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本固定化酶可以被反復(fù)使用，更經(jīng)濟，更利于生產(chǎn)反應(yīng)后會混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量(難分離）酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離純化 固定化酶載體應(yīng)具備以下要求大體上有：1)在酶催化反應(yīng)過程的惰性：載體應(yīng)不與底物、產(chǎn)物及介質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。2)有良好的滲透性：制備成柱子后，能使底物和產(chǎn)物能快速通過減少吸附。3)有生物親和性和相容性，有利于酶活力發(fā)揮和穩(wěn)定。4)有較高酶負載量，載體表面能提供多個活性位點利于酶分子偶聯(lián)。二、實驗原理：一般酶的固定化方法：吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法、包埋法。1、一般酶固定化的傳統(tǒng)：吸附法、共價偶聯(lián)法、

3、交聯(lián)法、包埋法。吸附法利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和離子吸附法。常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。采用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，可反復(fù)使用。包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個方法比較簡便，酶分子僅僅是被包埋起來，酶生物活性被破壞的程度低，但此法對大分子底物不適用。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細胞，制成固定化細胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌體，可連續(xù)水解帤基青霉素

4、，工業(yè)生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸。結(jié)合法酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過離子鍵結(jié)合而使酶固定的方法，叫離子鍵結(jié)合法。其間形成化學共價鍵結(jié)合的固定化方法叫共價鍵結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法結(jié)合力牢固，使用過程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較強烈，所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。交聯(lián)法依靠雙功能團試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于水從而形成固定化酶。常采用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)法是用多功能試劑進行酶蛋白之間的交聯(lián)，使酶分子和多功能試劑之

5、間形成共價鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：( 1) 單獨與酶作用；( 2) 酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)；( 3) 多功能團試劑與載體反應(yīng)得到有功能團的載體，再連接酶。交聯(lián)劑的種類很多，最常用的是戊二醛，其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N，N-乙烯馬來酰亞胺等。交聯(lián)法的優(yōu)點是酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性較高；缺點是有的方法固定化操作較復(fù)雜，進行化學修飾時易造成酶失活。各類固定化方法的特點比較:比較項目吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理化學方法分類物理吸附化學共價鍵結(jié)合物理離子鍵結(jié)合化學鍵連接物理包埋制備難易易難易較

6、難較難固定化程度弱強中等強強活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶2、 淀粉酶催化反應(yīng)：淀粉酶：淀粉酶是指一類能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷鍵的酶之總稱。淀粉酶包括：淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脫支酶、麥芽寡糖生成酶等水解酶類和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶、環(huán)狀糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等。淀粉酶是一種內(nèi)切酶，它隨機地從分子內(nèi)部切開14糖苷鍵(水解中間的14鍵比分子末端的14鍵概率大)，遇到分支點的16鍵不能切，但能跨越分支點而切開內(nèi)部的14糖苷鍵，由于產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖殘基上的C1碳原子呈構(gòu)

7、型(光學)，故稱這種酶為淀粉酶。淀粉酶的水解反應(yīng)：淀粉在淀粉酶的作用下很快被切割成分子較小的糊精、低聚糖、麥芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降，對碘呈色反應(yīng)為籃紫紅無色，又叫液化酶。淀粉酶的水解產(chǎn)物：水解直鏈淀粉，首先將淀粉降解為寡糖、麥芽三糖和麥芽糖，然后將寡糖、麥芽三糖進一步降解為麥芽糖和葡萄糖；水解支鏈淀粉，由于不能水解-1.6糖苷鍵，產(chǎn)物除麥芽糖、少量葡萄糖外，還有帶-1.6鍵的小分子極限糊精。糊精:分子式為(C6H10O5)nH2O，為白色或類白色的無定形粉末；無臭，味微甜。在沸水中易溶，在乙醇或乙醚中不溶。直鏈淀粉顯藍色，據(jù)認為這是由于葡萄糖單位形成六圈以上螺旋所致。其分子量約1萬-20

8、0萬,250-260個葡萄糖分子,以 (1 4)糖苷鍵聚合而成.呈螺旋結(jié)構(gòu)。一個螺旋圈所含葡萄糖基數(shù)稱為聚合度或重合度,當?shù)矸坌纬陕菪龝r,碘分子進入其中,糖的羥基成為供電子體,碘分子成為受電子體,形成絡(luò)合物.而支鏈淀粉除了 (1 4)糖苷鍵構(gòu)成糖鏈以外,在支點處存在 (1 6)糖苷鍵,分子量較高.遇碘顯紫紅色.遇碘顯紫紅色。淀粉水解時一般先生成淀粉糊精（遇碘呈藍色），進而生成紅糊精（遇碘顯紅色），再生成無色糊精（遇碘不顯色）及麥芽糖，最終生成葡萄糖。糖元遇碘顯紅色?？偨Y(jié)一下：當鏈長小于6個葡萄糖時,不能形成一個螺旋圈.當聚合度為20左右時,碘遇淀粉顯紅色當聚合度為2060時,碘遇淀粉顯紫紅色當

9、聚合度大于60時,碘遇淀粉顯藍色） -淀粉酶 淀粉酶 糖化淀粉酶淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖遇碘顯藍色 遇碘顯紅色（淀粉遇碘顯色原理：淀粉、糊精等與碘結(jié)合為淀粉/糊精-碘包合物顯色。分子結(jié)構(gòu)不同，結(jié)合方式不同，顏色不同。）3. 石英砂的吸附作用 石英砂吸附酶的物理吸附也稱范德華吸附，它是由吸附質(zhì)和吸附劑分子間作用力所引起，此力也稱作范德華力。由于范德華力存在于任何兩分子間，所以物理吸附可以發(fā)生在任何固體表面上。吸附劑表面的分子由于作用力沒有平衡而保留有自由的力場來吸引吸附質(zhì)，由于它是分子間的吸力所引起的吸附，所以結(jié)合力較弱，吸附熱較小，吸附和解吸速度也都較快。被吸附物質(zhì)也較容易解吸出來，所以物理

10、吸附在一定程度上是可逆的。如：活性炭對許多氣體的吸附，被吸附的氣體很容易解脫出來而不發(fā)生性質(zhì)上的變化。同一物質(zhì)，可能在低溫下進行物理吸附而在高溫下為化學吸附，或者兩者同時進行。吸附作用的大小跟吸附劑的性質(zhì)和表面的大小、吸附質(zhì)的性質(zhì)和濃度的大小、溫度的高低等密切相關(guān)。如活性炭的表面積很大，吸附作用強；活性炭易吸附沸點高的氣體，難吸附沸點低的氣體。吸附質(zhì)分子與吸附劑表面原子或分子間以物理力進行的吸附作用。這種物理力是范德瓦耳斯力，它包括色散力、靜電力和誘導力。對于極性不大的吸附質(zhì)和吸附劑，色散力在物理吸附中起主要作用。當極性分子與帶靜電荷的吸附劑表面相互作用，或因吸附質(zhì)與吸附劑表面分子作用，使二者

11、的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而產(chǎn)生偶極矩時，定向力和誘導力在物理吸附中也有重要作用。有時吸附質(zhì)分子與吸附劑表面以形成氫鍵的形式發(fā)生物理吸附。 （總體來說）實驗原理：本實驗是用吸附法將a-淀粉酶固定在石英砂上，一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示劑溶液測試，流出物呈紅色表明水解產(chǎn)物糊精生成。 這里使用的是枯草桿菌的a-淀粉酶，其作用的最適pH范圍：pH5.5-7.5，最是溫度為50-75三、實驗材料： 1、a-淀粉酶：容易購買，價格適宜。2、 石英砂：堅硬、耐磨、性能穩(wěn)定、危險性低、易尋便宜，適用于a-淀粉酶的固定。3、 淀粉：在a-淀粉酶促進反應(yīng)前后都可與碘液反應(yīng)產(chǎn)生不同顏

12、色，易被碘液檢測觀察。四、實驗器材： 物品準備表藥品名稱小組用量總準備用量物品名稱小組用量總準備用量淀粉酶 5mg70mg層析柱1個12個石英砂 5g70g濾布1張12張淀粉 25mg400mg50ml燒杯2個24個KI-I2溶液 1ml15ml200ml燒杯1個3個蒸餾水 3000ml5ml指形管3個36個50ml量筒1個12個膠頭滴管 -12個玻璃棒1個12個電子天平1個電爐1個試管支架1個4個廢液桶4個實驗試劑的配制方法：0.5 mmol/L KI-I2，陰涼且通風良好環(huán)境下保存。（KI的作用：碘在水中的溶解度不大，加入KI后，發(fā)生可逆反應(yīng)，使碘的溶解度增大，可得到較濃的碘水同時，碘溶液

13、中的碘容易被氧化，加入碘化鉀可還原，并抑制其繼續(xù)氧化）五、實驗步驟：1、配制可溶性淀粉溶液。用電子天平稱取25mg可溶性淀粉溶于50ml沸水（可溶性淀粉先用冷水調(diào)成糊狀，再加入沸水中至50ml）。將配制好的淀粉溶液放置在60的水浴鍋中備用。（注意：此數(shù)據(jù)為一組實驗的用量，若配全班用量乘以實驗小組數(shù)即可，可由授課教師配制全班用量以節(jié)省時間。）【方案改進：淀粉溶液在70水浴鍋中保溫，且在水浴鍋中已為學生準備好用100ml燒杯裝的配制好的淀粉溶液，注意囑咐學生要在用層析柱反應(yīng)時才拿出來，勿提前拿；而之前檢測石英砂固定a-淀粉酶的上清液所用淀粉于水浴鍋中大燒杯中取，避免小燒杯中淀粉溶液取出來之后溫度降

14、低致使反應(yīng)結(jié)果不佳?！?、a-淀粉酶的固定化。在50ml燒杯中將電子天平稱取的5mg a-淀粉酶溶于4ml蒸餾水中，由于酶不純，可能有些不溶物，再加入電子天平稱取的5g石英砂，不時攪拌，固定化15分鐘。（注意：攪拌時用力不可太猛及攪拌時間不易過長，以免石英砂被磨細穿過濾布帶入到流出液中，攪拌的速度應(yīng)是緩慢的，攪拌時間過長也不易酶的固定，這里授課老師可以做示范動作讓學生來體會。）【方案改進：由于實驗時間不足的問題，此步驟由教師準備?！?、小心倒掉上清液后，（每次）用10-15ml的蒸餾水小心清洗石英砂2-3次，每次取其上清液0.5ml于試管中，同時滴加淀粉溶液充分混勻。再加入1-2滴KI-I2

15、溶液，若溶液變?yōu)樗{色，說明中已無游離a-淀粉酶，如果溶液為紅色，繼續(xù)用蒸餾水清洗，直至淀粉溶液變?yōu)樗{色為止。（檢測未吸附的游離淀粉酶是否洗滌干凈）4、先把濾布放入固定化酶裝柱中，再裝入固定有a-淀粉酶的石英砂約4ml，裝柱過程中可在裝有石英砂的燒杯中加入少量蒸餾水，便于石英砂流入層析柱，同時適當打開層析柱的調(diào)節(jié)裝置，使多余的液體可以流出。（加入少量蒸餾水的目的是讓固定好a-淀粉酶的石英砂盡量全部裝進柱中，裝柱時應(yīng)盡量使石英砂的表面平整，這樣可以使淀粉溶液充分與酶反應(yīng)。流出的液體主要是加入的蒸餾水）5、將灌注了固定化酶的層析柱放在支架上，用滴管加淀粉溶液后，調(diào)節(jié)層析柱的調(diào)節(jié)裝置使淀粉溶液約以0.

16、3ml/min(6滴/min)的流速過柱，在流出1-2ml反應(yīng)液后（讓塑料管中的水流出），轉(zhuǎn)動關(guān)閉層析柱的調(diào)節(jié)裝置，放置5min（讓淀粉液充分與酶反應(yīng)）。6、打開調(diào)節(jié)裝置，0.3ml/min(6滴/min)的流速過柱，在流出1-2ml反應(yīng)液后（1-2ml液為：裝柱下面塑料管中未充分反應(yīng)的淀粉液）（10滴，20滴為1ml），按以下表格在試管中加入相應(yīng)試劑，觀察結(jié)果。 實驗記錄表樣品淀粉溶液流出液流出液（稀釋1倍）1滴KI-I2 溶液參考結(jié)果對照+碘色對照+ +藍色樣品1 +紅色樣品2 + +淺紅色固定后的a-淀粉酶可以重復(fù)使用，實驗后用10倍柱體積蒸餾水洗滌固定化酶柱，然后放置4冰箱保存。注意事

17、項：1、a-淀粉酶的固定化過程中，用力不易過猛，攪拌時間不易過長。 2、加固定好酶的石英砂入層析柱時，勿先加液體，應(yīng)直接用玻璃棒將石英砂弄入層析柱。3、在層析柱中加入溶液不要過快，防止石英砂表面不平整。我們小組對方案的改進（預(yù)實驗后確定）：1. 可溶性淀粉濃度：可設(shè)置可溶性淀粉濃度梯度，確定最適淀粉濃度 溶液名稱濃度（mg/mL) 配制方法 可溶性淀粉溶液15mg可溶性淀粉溶于50mL沸水25mg可溶性淀粉溶于50mL沸水35mg可溶性淀粉溶于50mL沸水（根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，0.7mg/ml濃度太高，會使結(jié)果的顏色參雜藍色，而0.3mg/ml濃度太低，顏色沒有0.5mg/ml濃度的淀粉溶液好，故

18、仍用原方案）2.反應(yīng)時間:可將第5步步驟改為流出1-2ml后，直接放置10min.（原因：簡易步驟，增加酶與淀粉的反應(yīng)時間） 實驗對比方案：編號 方案 1 2（據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，用0.3ml/min流速過柱比不過柱好，不流動的實驗組結(jié)果不理想，推測應(yīng)因淀粉未與a-淀粉酶充分接觸。）最終改進方案：1、由于實驗時間不足的問題，步驟1、2由教師準備。 2、淀粉溶液在70水浴鍋中保溫，且在水浴鍋中已為學生準備好用100ml燒杯裝的配制好的淀粉溶液，注意囑咐學生要在用層析柱反應(yīng)時才拿出來，勿提前拿；而之前檢測石英砂固定a-淀粉酶的上清液所用淀粉于水浴鍋中大燒杯中取，避免小燒杯中淀粉溶液取出來之后溫度降低致使

19、反應(yīng)結(jié)果不佳。思考： 1. 與游離酶相比，固定化酶有哪些優(yōu)缺點？（l）極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；（2）可以在較長時間內(nèi)進行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；（3）在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；（4）酶反應(yīng)過程能夠加以嚴格控制；（5）產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；（6）較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；（7）可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量（8）酶的使用效率提高，成本降低。2. 選擇固定化方法時要注意哪些基本原則？1）必須注意維持酶的催化活性及專一性，保持酶原有的專一性、高效催化能力和在常溫常壓下能起催化反應(yīng)的特點2）固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化、 連續(xù)化3）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻4

20、）酶與載體必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復(fù)使用5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，在制備固定化酶時，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學反應(yīng)6）固定化酶應(yīng)易與產(chǎn)物分離7）固定化酶成本要低，應(yīng)為廉價的、有利于推廣的產(chǎn)品，以便于工業(yè)使用8）充分考慮到固定化酶制備過程和應(yīng)用中的安全因素3. 為什么固定化后酶的穩(wěn)定性得以提高？ 定化后酶分子與載體多點連接，增加了 酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形。阻擋了不利因素對酶的侵襲。抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載體結(jié)合后，由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了自降解。4. 經(jīng)過固定化后，酶的特性有哪些改變？1）酶的催化活力變化：固定化酶

21、的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生改變2）穩(wěn)定性的影響（熱穩(wěn)定性、對各種有機試劑、對酶抑制劑、對不同pH、對蛋白酶、儲存穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性3）最適pH變化.：由于固相化后酶蛋白電荷狀態(tài)變化和受載體表面電荷的影響，使得對底物作用的pH活性曲線和最適pH都將發(fā)生變化，最適pH可能將酸性或堿性方向移動，不同酶與pH有關(guān)的變化需通過實驗來確定。4）最適溫度的變化（提高，少數(shù)不變或下降）5、新型酶固定化技術(shù)有哪些，各有什么優(yōu)缺點？酶固定化的新技術(shù)、新方法微波/超聲輔助固定化微波是一種電磁波，波長為0.1100 cm。微波加熱的主要原理是介質(zhì)材料的極性分子在微波高頻電場的作用下反復(fù)快速取向轉(zhuǎn)動而摩擦生熱，是從物質(zhì)內(nèi)部開始，瞬時達到需要的溫度。微波加熱具有許多傳統(tǒng)加熱不具備的優(yōu)點，