核酸檢測實驗室建立與應用

1、2022-3-101核酸檢測實驗室建立與應用衛(wèi)生部臨檢中心深圳市血液中心血液病毒核酸檢測聯(lián)合實驗室葉賢林2022-3-102核酸擴增檢測實驗室的建立n人員n場地n檢測方法選擇n實施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號）2022-3-103核酸實驗室人員要求n資質(zhì):經(jīng)過臨檢中心PCR培訓班培訓并取得上崗證；通過血站核酸實驗室崗前培訓考試合格。n 培訓:無”核酸”的概念形成, 防污染的概念良好工作習慣的培養(yǎng). 報告的正確發(fā)放.n后備人員的培養(yǎng).2022-3-104試劑準備區(qū)試劑準備區(qū)標本制備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)樣本離心交

2、接區(qū)報告發(fā)放區(qū)核酸實驗場地2022-3-105 方法選擇: TMA與PCRTMAPCR擴增原理擴增原理模擬自然模擬自然 DNA 轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄成 mRNA 的過程的過程模擬自然模擬自然DNA復制的過程復制的過程靶目標靶目標RNADNA酶酶MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及逆轉(zhuǎn)錄酶及T7 RNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶反應體系反應體系兩種酶，兩條引物，兩種酶，兩條引物，dNTP, NTP一種酶，一對引物，一種酶，一對引物，dNTP溫度條件溫度條件恒溫（恒溫（41.5 ）循環(huán)導熱循環(huán)導熱（變性，退火，延伸）（變性，退火，延伸）擴增儀器擴增儀器水浴箱或者加熱塊水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀熱循環(huán)儀擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物RN

3、ADNA擴增速度擴增速度每個循環(huán)可以生成每個循環(huán)可以生成100-1000個復制物，個復制物，在在15-30分鐘內(nèi)可增加分鐘內(nèi)可增加10億倍復制物億倍復制物以以2n擴增，擴增，23 h就能將待就能將待擴目的基因擴增放大擴目的基因擴增放大10億倍億倍2022-3-106 TMA的優(yōu)點 缺點自自動動化程度高化程度高靈靈敏度高敏度高擴擴增效率高：增效率高：10n 不能不能絕對絕對定量定量2022-3-107 PCR的優(yōu)點 缺點易于自易于自動動化化靈靈敏度高敏度高 擴擴增效率高增效率高匯匯集拆分集拆分過過程繁程繁瑣瑣 拆分可拆分可減減低非反低非反應應性比率性比率2022-3-108核酸試劑質(zhì)控核酸試劑質(zhì)

4、控n試劑的確認 試劑運輸過程的控制(溫度條件時限) 靈敏度的要求 內(nèi)標的要求n試劑涵蓋的基因型 2022-3-109檢測流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標本檢測流程2022-3-1010檢測流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標本檢測流程2022-3-1011檢測流程(3):平行檢測流程樣本清點交接核酸單份檢測常規(guī)檢測合格標本不合格標本陰性標本反應性標本合格標本發(fā)布結(jié)果單項目反應性無反應性 陽性或可疑結(jié)果淘汰 陽性或可疑結(jié)果淘汰2022-3-1012標準操作規(guī)程(SOP)的編寫n核酸實驗室設(shè)置與管理規(guī)范n核酸實驗室標本檢測流程n核酸實驗室崗位職責n核酸實驗室關(guān)鍵試劑管理規(guī)范n核酸實驗室儀器設(shè)備管理規(guī)范n

5、核酸實驗室檢測標本管理規(guī)范n核酸實驗室室間質(zhì)量評價規(guī)范n核酸實驗室記錄管理制度n核酸實驗室生物防護規(guī)范n核酸反應性獻血者追蹤規(guī)程n核酸實驗室檢測應急措施2022-3-1013標準操作規(guī)程(SOP)的編寫n核酸標本離心交接操作規(guī)程n核酸標本提取及匯集操作規(guī)程(科華) n核酸標本擴增檢測操作規(guī)程（科華）n核酸標本全自動檢測分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）n核酸標本檢測報告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）n核酸標本檢測復檢操作規(guī)程n生物安全柜標準操作規(guī)程n可移動紫外線燈標準操作規(guī)程n低溫高速離心機標準操作規(guī)程nABI 7300型核酸擴增熒光檢測儀標準操作規(guī)程 2022-3-1014 核酸實驗室防污染措施污染

6、措施n主要的污染源n擴增產(chǎn)物n標本之間產(chǎn)生的氣溶膠n操作人員n手n衣服2022-3-1015核酸實驗室防污染措施污染措施n要有獨立的空氣處理系統(tǒng).n各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通n實驗室保持合理的通風n對各區(qū)內(nèi)的設(shè)備、物料進行標示，專區(qū)專用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）n空氣：試劑準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)n試劑陽性對照儲存在標本制備區(qū)n使用帶濾芯的吸頭 2022-3-1016核酸實驗室防污染措施污染措施n使用外排式的生物安全柜n自配試劑應分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應廢棄n使用次氯酸鈉溶液消毒（臺面、地面）n使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）n使用紫外線照射（空

7、氣和臺面）n使用無水乙醇溶液（空氣噴霧）2022-3-1017核酸實驗室污染后措施污染后措施n實驗室污染后，如何處理？n通風n次氯酸鈉溶液（擴增區(qū)不宜使用）nHCL溶液（吸頭）n紫外線（固定、移動）n酒精噴灑（空氣）n應設(shè)計有備用實驗室 : 如開設(shè)獨立的報告發(fā)放區(qū)作為備用 2022-3-1018中心理念：監(jiān)測全程的實驗過程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及擴增過程的效率。血篩核酸檢測的內(nèi)標的作用血篩核酸檢測的內(nèi)標的作用內(nèi)標的作用質(zhì)控整個反應。提示假陰性檢測結(jié)果。監(jiān)控反應的外部條件內(nèi)標濃度要合適保持適度的內(nèi)標失控.( ChiSq Intercept 1 -4.6852 1.5659 -7.7542 -1

8、.6161 8.95 0.0028log10(Dose) 1 4.8000 1.4699 1.9190 7.6810 10.66 0.0011 應用SAS9.0軟件PROBIT分析結(jié)果2022-3-1022 Probit Analysis on Dose Probability Dose 95% Fiducial Limits 0.50 9.57017 5.12038 15.55110 0.55 10.63175 6.02869 17.84047 0.60 11.83113 7.02737 20.77334 0.65 13.21316 8.12392 24.64098 0.70 14.8446

9、7 9.33581 29.90750 0.75 16.83205 10.69944 37.36963 0.80 19.35973 12.28641 48.54111 0.85 22.78900 14.24179 66.74000 0.90 27.97953 16.90417 101.07479 0.91 29.40116 17.58727 111.93157 0.92 31.02755 18.34915 125.13015 0.93 32.91988 19.21204 141.54165 0.94 35.17006 20.20878 162.54851 0.95 37.92474 21.390

10、86 190.498222022-3-10232022-3-1024陽性獻血者的追蹤n溝通原則:專業(yè)授權(quán)、人性化、保密、尊敬。n溝通方式：電話、面談n溝通技巧：表揚和鼓勵、合理解釋、知情、適當?shù)膯柡?022-3-1025獻血者核酸檢測不合格解釋 n由于核酸檢測方法目前尚不能排除假陽性，對由于核酸檢測方法目前尚不能排除假陽性，對實驗過程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進入實驗過程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測不合格血液僅表示該血液臨床，因此核酸檢測不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不能用于臨床輸

11、血。n不作為獻血者健康體檢指標。不作為獻血者健康體檢指標。n更不宜作為疾病診療指標。更不宜作為疾病診療指標。n獻血者獻血權(quán)利仍保留。獻血者獻血權(quán)利仍保留。2022-3-1026關(guān)于核酸檢測的解釋n匯集結(jié)果成反應性,拆分結(jié)果為陰性.n內(nèi)標失敗.nELISA(+),核酸結(jié)果為(-)nELISA(-),核酸結(jié)果為(+)n核酸單檢結(jié)果反應性與血液發(fā)放.n化學發(fā)光法與核酸檢測.2022-3-10271.1.靈敏度：匯集池大小要滿足靈敏度要求。靈敏度：匯集池大小要滿足靈敏度要求。靈敏度太低，病毒低載量獻血者漏檢。靈敏度太低，病毒低載量獻血者漏檢。HBV DNA HBV DNA 靈敏度宜靈敏度宜5050拷貝

12、拷貝/ml./ml.2.2.引物是否有效性引物是否有效性, ,能否檢測亞型和突變株感染。能否檢測亞型和突變株感染。3.3.假陽性，防污染措施（血篩主要要防止假陽性，防污染措施（血篩主要要防止RNARNA酶的酶的污染）。污染）。4.4.核酸提取效率與自動化核酸提取效率與自動化. .5.5.需要規(guī)范化場地和高素質(zhì)的操作人員需要規(guī)范化場地和高素質(zhì)的操作人員. .6.6.參加國際間室間質(zhì)控參加國際間室間質(zhì)控, ,提高檢測水準提高檢測水準. .血液核酸篩查注意的問題血液核酸篩查注意的問題2022-3-1028深圳血液中心核酸檢測概況n對161228人份酶免疫檢測結(jié)果陰性標本進行核酸檢測，共檢出33例不相

13、同HBV DNA陽性獻血者，總比率為1：4885。n檢出anti-HCV陰性、 HCV RNA陽性1例，定量結(jié)果為1.2105IU/ml。3個月后追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。 2022-3-1029項目項目科華（自動化）科華（自動化）科華（半自科華（半自動化）動化）美國羅氏美國羅氏上海浩源上海浩源凱榮凱榮（CHIROCHIRON N）方法學方法學全自動提取全自動提取+實實時熒光時熒光PCR病毒離心富病毒離心富集集+半自動半自動提取提取+實時實時熒光熒光PCR全自動提全自動提取取+ PCR-ELISA半自動提半自動提取取+ PCR+毛細管毛細管電泳分電泳分

14、離離TMA匯集量匯集量 845ul8150ul2445ul5200ul500 ul 單人單人份份檢測數(shù)檢測數(shù)6849637041315121412514603HBV DNA陽陽性數(shù)性數(shù)122838HBV陽性比陽性比率率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸檢測概況2022-3-1030HBV DNA陽性獻血者追蹤情況 n對17位HBV DNA陽性獻血者進行了追蹤，9位獻血者發(fā)生血清轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。n4例呈窗口期特征（或部分），n2例獻血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象n1例獻血者原為乙肝大三陽患者，經(jīng)治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰后，獻血，常規(guī)檢測為合格，核酸檢測HBV DNA

15、（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛栃?022-3-10312022-3-10322022-3-10332022-3-10342022-3-10352022-3-1036 HBV DNA檢測陽性獻血者追蹤概況追蹤時間(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18+21241504528未檢出9126未檢出15631未檢出21429未檢出2022-3-1037 1號獻血者在追蹤時表明曾經(jīng)是大三陽,治療轉(zhuǎn)陰后獻血,被核酸檢出陽性,7天后 HBsAg 檢測(+). 2022-3-10382022-3-10391.Pooling by STAR processor2.Virus enrichment by centrfugation3. Extracted by KHB-10004. Amplified and d