對胃粘膜損傷有輔助保護功能評價方法

1、附件2：對胃粘膜損傷有幫助保護功能評價方法試驗項目、試驗原則及結果判定Items, Principles and Result Assessment1 試驗項目1.1 動物實驗 體重 胃粘膜大體損傷狀況 胃粘膜病理損傷積分1.2 人體試食試驗 臨床癥狀 體征胃鏡觀察2 試驗原則2.1 動物實驗和人體試食試驗所列指標均為必做項目。2.2 無水乙醇、消炎痛致急性胃粘膜損傷模型或冰醋酸致慢性胃粘膜損傷模型任選其一進行動物實驗。2.3 在進行人體試食試驗時，應對受試樣品的平安性作進一步的觀察。3 結果判定3.1 動物實驗：實驗組與模型對比組比較，大體觀察評分與病理組織學檢查評分結果均表明胃粘膜損傷明顯

2、改善，可判定該受試樣品動物實驗結果為陽性。3.2 人體試食試驗：試食組與對比組比較，臨床癥狀、體征積分明顯削減，胃鏡復查結果有改善，可判定該受試樣品對胃粘膜有幫助保護功能。對胃粘膜損傷有幫助保護功能檢驗方法Method for the Assessment of Protectionof Gastric Mucosa Function1 動物實驗1.1 原理在肯定時間內給予肯定量的受試樣品，用對胃粘膜有損傷作用的物質造成急性胃粘膜損傷模型，觀察各劑量組胃粘膜的損傷程度；或用對胃粘膜有損傷作用的物質造成慢性胃潰瘍模型，在肯定時間內給予肯定量的受試樣品，觀察各劑量組胃潰瘍的面積和體積，反映受試樣品

3、對胃粘膜的保護作用。1.2 實驗動物選用SD或Wistar 健康大鼠，單一性別，180220克，每組812只。1.3 實驗設計及劑量分組受試物設三個劑量組，其中一個應為人體推舉量的5倍劑量組，并同時設置正常對比組。不同的損傷模型，還應設置相應的模型對比組。慢性潰瘍模型應先造模，手術次日再分組。受試樣品給予時間一般為1430天，必要時可以延長至45天。 1.4 胃粘膜損傷模型 急性胃粘膜損傷酒精模型.1 實驗動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。.2 實驗器材及試劑：解剖器械，游標卡尺，酒精或醋酸，病理制片系統(tǒng)，生物顯微鏡等。.3 實驗方法：動物隨機分正常對比組、模型組和受試樣品三個劑

4、量組。各劑量組灌胃樣品30天后，全部動物嚴格禁食24小時（不禁水），此期間亦禁止給予受試物。除空白對比外，全部試驗組動物給予無水乙醇1.0ml/只，1小時后處死動物，暴露完整胃，結扎幽門，灌注適量10%甲醛溶液，固定20min，然后沿胃大彎剪開，洗凈胃內容物，展開胃粘膜，在體視解剖顯微鏡下或肉眼下用游標卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度。因寬度所代表損傷的嚴峻性遠較長度大，故雙倍積分。其評分標準見表1。表1 急性酒精損傷肉眼觀查評分標準損傷程度1分2分3分4分 出血點1個- 出血帶長度1-5mm6-10mm10-15mm>15mm 出血帶寬度1-2mm>2mm 總積分 = 出血點分

5、值+長度分值+（寬度分值´2）觀察指標：各實驗組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷積分指數和損傷抑制率表示。損傷發(fā)生率（%）= 某組消失出血或潰瘍的大鼠數量該組大鼠數量×100%；損傷積分指數 = 組損傷評分總和組動物數量；損傷抑制率（%）= (A-B) /A´100%（A、B分別為模型組與試驗組的損傷積分）。病理組織學觀察及評分：大體檢查完畢，將每只動物胃粘膜損傷最嚴峻的部位切下，固定于10%甲醛溶液，常規(guī)制片，HE染色，鏡下觀察。注意選擇胃粘膜正橫切面，包括粘膜全層的區(qū)域觀察。評分方法：以充血、出血、粘膜細胞變性壞死在整個粘膜上皮層的累及程度分為5級。充血

6、權重為1，出血權重為2，上皮細胞變性壞死權重為3，評分標準及病變總積分公式見表2。表2 急性胃粘膜損傷鏡下評分標準病變1分2分3分4分5分充血 1/51/5 - 2/52/5 - 3/53/5 - 4/5上皮全層出血 1/51/5 - 2/52/5 - 3/53/5 - 4/5上皮全層上皮細胞變性壞死 1/51/5 - 2/52/5 - 3/53/5 - 4/5上皮全層病變總積分 = 充血積分+出血積分´2+上皮細胞變性壞死積分´31.4.2急性胃粘膜損傷消炎痛模型1.4.2.1 實驗動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.2.2 實驗器材及試劑：解剖器械或

7、游標卡尺，病理制片系統(tǒng)；消炎痛，甲醛等。1.4.2.3 實驗方法：動物隨機分正常對比組、模型組和受試樣品三個劑量組，灌胃給予動物受試物30天后，禁食不禁水24小時，模型組和劑量組給予消炎痛40mg/kg一次性腹腔注射。5小時后處死動物，剖腹將胃取出，結扎幽門和賁門，從十二指腸與幽門部結合處注入10%甲醛溶液5 ml，固定20分鐘后，沿胃大彎剪開，洗凈胃內容物，展開胃粘膜，用紙吸干，觀察胃粘膜損傷程度。用游標卡尺測量胃出血或潰瘍的最大長度及寬度，以出血或潰瘍的最大長寬徑作為損傷指標評分。消炎痛所致胃粘膜損傷的潰瘍一般較小，肉眼觀查以點狀多見，其評分標準見表3。表3 急性胃粘膜損傷消炎痛模型評分標

8、準損傷形態(tài)1分2分3分4分出血點1個-出血帶長度1-2mm2-4mm4-6mm>6mm出血帶寬度1-2mm>2mm總積分 = 出血點分值+長度分值+（寬度分值´2）注：長度和寬度均以最大徑計。觀察指標：各實驗組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷指數和損傷抑制率表示。損傷發(fā)生率（%）= 某組消失出血或潰瘍的大鼠數量該組大鼠數量×100%；損傷指數 = 組損傷評分總和組動物數量；損傷抑制率（%）=(A-B)/A´100%（A、B分別為模型組與試驗組的損傷積分）病理組織學觀察及評分：同急性胃粘膜損傷酒精模型。1.4.3 慢性胃潰瘍模型1.4.3.1 動物

9、：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.3.2 實驗器材及試劑：帶標尺的解剖鏡、微量注射器，醋酸、半胱氨酸等1.4.3.3 實驗方法：.3.1 醋酸注射法：將動物禁食不禁水24小時，乙醚或1%巴比妥鈉麻醉后實施剖腹手術，消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將胃輕拉出腹腔外，用微量注射器于胃幽門處漿膜下注射20-30ml的30%冰醋酸，縫合切口，術后正常喂食和水。其次天將手術后狀態(tài)良好的動物按體重隨機分為模型組和受試樣品三個劑量組。各劑量組按相應劑量灌胃，連續(xù)14天。模型組灌胃蒸餾水或溶劑。禁食24小時后處死，取出整個胃浸泡于10%的甲醛內，浸泡20分鐘后沿胃大彎剪開，洗凈內容物，取腺胃區(qū)展

10、開平鋪于玻璃板上，用紙吸干潰瘍內的水分，測量其面積和體積。潰瘍面積和體積測量法：于帶標尺的解剖顯微鏡下計數潰瘍所占的方格數，換算成面積。然后用微量注射器將有色墨水注入潰瘍內，將潰瘍填滿與周邊平齊，讀取微量注射器上刻度即為潰瘍的體積。.3.2 冰醋酸浸漬法：將動物禁食不禁水24小時，乙醚或1%巴比妥鈉麻醉后實施剖腹手術，消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將內徑5mm、長30mm的玻璃管垂直放置胃體部粘膜上，向管腔加入冰醋酸0.2ml，1.5分鐘后用棉簽蘸出冰醋酸，縫合手術切口，術后正常喂食和水，其次天將手術后狀態(tài)良好的動物按體重隨機分組、給藥，動物處置和測量等操作同上。1.5 數據處理和結果判定數據可

11、用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值< F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性。F值F0.05，即P0.05，用多個實驗組和對比組間均數的兩兩比較方法進行統(tǒng)計。對非正態(tài)或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統(tǒng)計。若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試物一個或一個以上劑量組與模型對比組進行比較，大體觀察評分與病理組織學檢查評分結果均表明胃粘膜損傷明顯改善，可判定該受試樣品動物實驗結果為陽性。1.6 注意事項動物禁食應完全，應嚴格掌握動物禁食期間食糞便、皮毛、墊料等。2 人體試食試驗

12、2.1 受試者的選擇標準 納入受試者標準：符合慢性淺表性胃炎診斷標準且經胃鏡篩選確診為胃粘膜損傷的自愿受試者。 慢性淺表性胃炎診斷標準：病程遷延，有不同程度的消化不良、上腹痛、燒心、噯氣、反酸、腹脹等臨床癥狀，可有上腹部輕度壓痛。符合慢性淺表性胃炎纖維胃鏡診斷標準及活體組織檢查診斷標準。排解胃潰瘍患者。 排解受試者標準：.1 年齡在18歲以下或65歲以上，妊娠或哺乳期婦女，過敏體質及對本樣品過敏者。.2 繼發(fā)性慢性胃炎。.3 合并有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)嚴峻疾病，精神病患者。.4 常常用藥、嗜酒、吸煙，4周內參加過其它實驗。.5 3個月內用過已知對胃腸功能有損害的藥物。.6 癥狀、體

13、征分級為重癥者。.7 有嚴峻消化系統(tǒng)潰瘍的病人。.8 正在服用其它治療藥物或接受其它治療者。.9 未按規(guī)定服用樣品，無法推斷功效，或資料不全等影響功效或平安性推斷者。2.2試驗設計及服樣期限接受組間和自身兩種對比設計。按受試者的癥狀輕重隨機分為試食組和對比組，盡可能考慮影響結果的主要因素如年齡、性別、病程等，進行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.3 受試樣品的劑量和使用方法試食組按推舉服用方法、服用量服用受試產品，在試驗期間停用其它用于慢性胃病的物品，對比組服有相同作用的陽性物。按雙盲法進行試食試驗。觀察時間不少于30天，必要時可延長至45天。試驗期間不轉變原來的飲食

14、習慣，正常飲食。2.4 觀察指標 平安性指標.1 一般狀況：包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等.2 血、尿、便常規(guī)檢查.3 肝、腎功能檢查 .4 胸透、心電圖、腹部B超檢查（僅在試驗開頭前檢查一次） 功效指標.1 癥狀觀察胃痛、噯氣、反酸、腹脹、食欲不振、少食等臨床癥狀。體征觀察劍突下壓痛程度。按癥狀輕重統(tǒng)計積分（重癥3分，中度2分，輕度1分），見表4。表4 人體試食試驗癥狀輕重分級表癥狀輕（1分）中（2分）重（3分）胃痛稍微，持續(xù)時間短，不影響工作及休息幸福時間較長，每日超4小時，尚能忍受，但對工作及休息有肯定影響疼痛較重，持續(xù)難忍，需服藥才能減輕噯氣偶有發(fā)作 常常發(fā)作，引及兩脅

15、不適頻繁發(fā)作，引及兩脅幸福反酸偶有吐酸飲食不適即吐酸頻繁吐酸腹脹腹脹稍微，時作時止，在短時間內可較甚腹脹較甚或發(fā)作頻繁，在較長時間內不緩解，影響工作及休息腹脹難忍，持續(xù)時間長，需服藥才能減輕少食食欲較差，飯量削減1/2以內飯量削減1/22/3無食欲，飯量削減2/3以上.2 胃鏡檢查與體征觀察劍突下壓痛程度檢查，依據幸福程度分為輕（1分）、中（2分）、重（3分）。輕度：用力時才消失幸福，壓痛稍微 1分中度：用力即消失幸福，但幸福尚能忍受，壓痛明顯 2分重癥：略微用力即消失幸福，幸福不能忍受，壓痛猛烈 3分隨機選擇試食組和對比組各15例受試者進行胃鏡檢查，比較試食試驗前后的轉變。2.5 數據處理和結果判定統(tǒng)計癥狀和體征積分值。試驗數據為計量資料，可用t檢驗進行分析。凡自身對比資料可以接受配對t檢驗，兩組均數比較接受成組t檢驗，后者需進行方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉換的數據進行t檢驗。若轉換數據仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t檢驗或秩和檢驗，但變異系數太大（如CV>50）的資料應用秩和檢驗。結果判定：試食前后試食組自身比較及試食后試食組與對比組組間比較，臨床癥狀、體征積分明顯