免疫抑制劑姜黃素逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗

1、【摘要】【目的】為探討姜黃素(curcumin)對(duì)胰島素反抗的治療作用及其機(jī)制?！痉椒ā坷靡葝u素反抗的小鼠模型,觀察姜黃素對(duì)小鼠胰島素反抗的水平、轉(zhuǎn)錄因子I-?資B?琢、循環(huán)細(xì)胞因子的變化?！窘Y(jié)果】姜黃素能抑制TNF?琢刺激Fao細(xì)胞NF-?資B激活;姜黃素治療后小鼠的空腹血糖水平?jīng)]有明顯下降,但空腹胰島素的水平下降約30,葡萄糖耐量曲線(xiàn)的水平也明顯下降;循環(huán)中TNF?琢(34.5±3.4)pg/mLvs(31.3±1.1)pg/mL水平?jīng)]有明顯轉(zhuǎn)變,而IL-1?茁(33.9±3.2)pg/mLvs(15.6±1.1)pg/mL和IL-6(72.1&#

2、177;9.8)pg/mLvs(47.2±5.3)pg/mL水平明顯被抑制;胰島素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明顯上升,而胰島素受體的磷酸化水平?jīng)]有明顯轉(zhuǎn)變。與IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明顯上升,AKT的磷酸化的水平也明顯上升。【結(jié)論】姜黃素能提高小鼠胰島素敏感性,有治療改善肥胖誘導(dǎo)的胰島素反抗的作用?！娟P(guān)鍵詞】姜黃素;NF-?資B;胰島素;反抗)姜黃(CurcumalongaL.)是常用中藥,臨床上用于活血、行氣、通經(jīng)、止痛。姜黃素(curcumin)是一種黃色色素,從姜黃中提取得到的主要有效成分。近年來(lái),大量商量發(fā)現(xiàn)它具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎及

3、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生理和藥理作用1-4。在實(shí)驗(yàn)室資料中姜黃素是良好的免疫調(diào)節(jié)劑,并有結(jié)果提示姜黃素可以抑制宿主抗移植物反應(yīng),而且提高受體動(dòng)物的存活率5,6。在實(shí)驗(yàn)商量中,炎癥又與胰島素反抗親密相關(guān)7,8。炎癥被證實(shí)是代謝綜合征的共同土壤,聯(lián)想到很多抗炎藥物如阿司匹林可以逆轉(zhuǎn)胰島素反抗,本文嘗試?yán)媒S素治療肥胖合并極度胰島素反抗的炎癥模型,并對(duì)姜黃素逆轉(zhuǎn)胰島素反抗的機(jī)制作初步探討。1材料與方法1. 1材料1.1. 1姜黃素購(gòu)于印度亞洲公司(純度99)。動(dòng)物Obob雄性小鼠16只,8周齡、空腹體質(zhì)量(3338g),購(gòu)自南京國(guó)家模式動(dòng)物中心,用含脂肪6.4的標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)前1周紀(jì)錄小鼠的

4、飼料攝取、空腹血糖、空腹胰島素水平及體量等。細(xì)胞購(gòu)自TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)。試劑IR、IRS-1、AKT、P85多克隆抗體由StevenShoelson實(shí)驗(yàn)室(JoslinDiabetesCenter,Harvard)供應(yīng)。FBSTNF?琢、胰島素購(gòu)自Sigma,St.LouisUSA,I-?資B?琢抗體,IKK?酌抗體,購(gòu)于SantaCruz,CA,GST-I-?資B(1-54)底物由BostonBiologicals,Wellesley,MA合成。1. 2方法體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)FAO細(xì)胞使用培育液DMEM(購(gòu)自Gibco公司),細(xì)胞置于37,

5、5CO2的培育箱中培育。在10cm培育皿用10mLDMEM+10FBS含有高濃度葡萄糖(25mmol/L)的培育液中培育至80重疊率,經(jīng)5mL0.1BSA孵育16h后接受不同濃度(040umol/L)的姜黃素預(yù)處理,然后接受鼠TNF?琢10nmol/L刺激處理,于20min后用預(yù)冷的PBS終止,并收集細(xì)胞,用于制作蛋白勻漿,備用,I-?資B?琢的水平用免疫印跡的灰度表示。NF-?資B的活性用20min內(nèi)試驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)比細(xì)胞I-?資B?琢灰度差值表示。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)利用食物參入法制成含2姜黃素的顆粒飼料(LabDiets,5008),低溫保存。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為中央通氣,層流環(huán)境,恒溫(23)、恒濕,12h

6、明暗光照循環(huán),24h任意飲食環(huán)境.動(dòng)物購(gòu)入后第5天開(kāi)頭接受口服葡萄糖耐量試驗(yàn),并留取空腹血漿作血漿胰島素水平,和其它循環(huán)因子的檢查。在驗(yàn)證空腹血糖和胰島素水平后動(dòng)物被隨機(jī)分成兩組,并接受姜黃素治療,對(duì)比組用顆粒飼料5008作為對(duì)比。每天記錄動(dòng)物的攝食量,每3周測(cè)量空腹血糖并留取空腹血漿1次,第6周空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行第2次口服葡萄糖耐量試驗(yàn),并留取空腹血漿。試驗(yàn)后連續(xù)接受姜黃素治療,第7周于空腹?fàn)顟B(tài)下接受5U/kg胰島素富強(qiáng)注射,注射后5min整,用斷頸法迅速處死動(dòng)物,留取肝臟經(jīng)液氮過(guò)渡后在-80低溫冰箱保存,作胰島素信號(hào)分析之用。血漿多種循環(huán)炎癥細(xì)胞因子的檢查用LincoResearch的Lumi

7、nex試劑盒并接受Luminex200監(jiān)測(cè)結(jié)果。免疫印跡細(xì)胞或組織裂解液(30mmol/LHepes,150mmol/LNaCl,1TritonX-100,pH7.4。蛋白酶抑制劑由1mmol/LPMSF,3?滋mol/Laprotinin,5?滋mol/Lpepstatin,10?滋mol/Lleupeptin,25mmol/LBenzamidin,2mmol/LNa-vanadate,5mmol/L?茁-glycerolphosphate,10mmol/LNaF,1mmol/LAmmoniumMolybdate,30mmol/Ltetrasodiumpyrophosphate,5mmol/

8、LEGTA)裂解細(xì)胞,SDS-聚丙烯酰胺凝膠(6),蛋白加熱變性后每孔加30?滋g,電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜。5脫脂奶粉TBS-T緩沖液洗膜,加一抗,4孵育過(guò)夜,TBS-T緩沖液洗膜,加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體(購(gòu)自AmershamUSA),室溫1h,TBS-T緩沖液洗膜,加ECL1min,暗室顯影23min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析接受t檢驗(yàn)。2結(jié)果2. 1姜黃素抑制NF-?資B的量效和時(shí)效關(guān)系Fao細(xì)胞在10cm2培育皿用10mL在10FBS+DMEM含有高濃度葡萄糖的培育液中培育至80重疊,經(jīng)5mL0.1BSA孵育16h后接受姜黃素預(yù)處理:劑量關(guān)系用梯度濃度如圖1

9、所示,時(shí)效曲線(xiàn)用30mol/L。預(yù)處理后接受鼠TNF10nmol/L刺激處理,于20min后用預(yù)冷的FBS終止,并收集細(xì)胞,用于制作蛋白勻漿。用免疫印跡檢測(cè)勻漿內(nèi)I-?資?注?琢的水平。如圖1A所示:20mol/L姜黃素20min預(yù)處理能夠抑制TNF刺激的I?資?注?琢的降解。從姜黃素的時(shí)效關(guān)系圖1B可見(jiàn),姜黃素有效劑量30mol/L對(duì)NF-B的抑制作用在3060min時(shí)最強(qiáng)。3. 2姜黃素以逆轉(zhuǎn)肥胖小鼠的胰島素反抗經(jīng)過(guò)6周姜黃素的治療,小鼠的空腹血糖水平?jīng)]有明顯下降,但空腹胰島素的水平下降約30(圖2),口服葡萄糖耐量曲線(xiàn)的水平也明顯下降(圖2A),曲線(xiàn)下面積的比較有明顯差異(Plt;0.0

10、1)。由空腹血糖和胰島素水平計(jì)算的HOMA指數(shù)用FBS(mmol/L)×胰島素(mmol/L)/22.5計(jì)算也呈明顯降低(Plt;0.05,圖2C),提示小鼠對(duì)胰島素反抗的水平得到明顯改善。4. 3姜黃素對(duì)循環(huán)細(xì)胞因子的影響Obob小鼠治療6周后的空腹血漿用LincoResearchLuminex試劑盒同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1?茁,IL-6和TNF?琢的水平。如圖3所示:盡管循環(huán)胰島素的水平明顯下降,但TNF?琢(34.5±3.4)pg/mLvs(31.3±1.1)pg/mL水平?jīng)]有明顯轉(zhuǎn)變,與之對(duì)應(yīng),循環(huán)中IL-1?茁(33.9±3.2)pg/mLvs

11、(15.6±1.1)pg/mL和IL-6(72.1±9.8)pg/mLvs(47.2±5.3)pg/mL水平明顯被抑制(Plt;0.05)。5. 4姜黃素為胰島素信號(hào)的增效劑經(jīng)胰島素刺激的肝臟組織在液氮下作粉碎并以1TritonX100RAPA(含有全部蛋白酶抑制劑,和蛋白磷酸酶抑制劑)緩沖液在冰點(diǎn)勻漿。經(jīng)全速4離心30min取上清液(1mg蛋白質(zhì))作IRS-1和IR聯(lián)合免疫沉淀。經(jīng)上樣緩沖液釋放的沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì)經(jīng)6的SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用4G10、P85、AKT抗體作免疫印跡。如圖4所示:胰島素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明顯上升,而

12、胰島素受體的磷酸化水平?jīng)]有明顯轉(zhuǎn)變。與IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明顯上升,AKT的磷酸化的水平也明顯上升。3商量胰島素反抗(IR)及胰島?茁細(xì)胞功能減退是2型糖尿病發(fā)病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)9,目前被認(rèn)為是一個(gè)慢性非特異性炎癥過(guò)程,胰島素對(duì)胰島素敏感組織作用的缺陷(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)會(huì)導(dǎo)致慢性、低水平炎癥狀態(tài)的惡化,任何與慢性炎癥有關(guān)的過(guò)程都會(huì)削弱胰島素的作用,作為惡性循環(huán),胰島素反抗又會(huì)使炎癥惡化10。在抗炎藥物對(duì)胰島素反抗有逆轉(zhuǎn)作用的報(bào)道之后,我們探究新的抗炎藥物對(duì)胰島素反抗的治療作用,姜黃素是繼阿司匹林后又一個(gè)具有類(lèi)似協(xié)同作用的活性成分11。在姜黃素治療6周后,

13、盡管治療組和對(duì)比組的體重沒(méi)有明顯改善,但小鼠空腹血糖的水平明顯下降,而且胰島素的水平也明顯降低,提示胰島素的敏感性明顯上升,葡萄糖耐量曲線(xiàn)在治療后也明顯改善,說(shuō)明小鼠整體對(duì)葡萄糖的處理能力明顯上升,即obob小鼠的胰島素反抗的水平得到明顯改善。這些都進(jìn)一步說(shuō)明姜黃素治療改善肥胖誘導(dǎo)的胰島素反抗。商量證實(shí)NF-?資B是啟動(dòng)和掌握炎癥的主要核轉(zhuǎn)錄因子,在非激活條件下,NF-?資B和胞漿內(nèi)一種被稱(chēng)為NF-?資B的抑制物(I-?資B)的蛋白質(zhì)結(jié)合處于無(wú)功能狀態(tài)。我們利用胰島素敏感組織來(lái)源的細(xì)胞系FAO,驗(yàn)證了姜黃素能夠抑制TNF?琢刺激的I?資B?琢的降解,繼而抑制NF-?資B的活性,我們推測(cè)在高度肥

14、胖NF-?資B高度激活的肥胖小鼠obob體內(nèi),姜黃素可能具有更加明顯的改善代謝的作用。在NF-?資B激活的模型上我們證實(shí)炎癥激發(fā)的高水平循環(huán)細(xì)胞因子是系統(tǒng)性胰島素反抗的緣由。接受細(xì)胞因子的中和抗體可以逆轉(zhuǎn)胰島素反抗,在NF-?資B抑制型模型,胰島素敏感性上升,而且循環(huán)中細(xì)胞因子的水平較低。在肥胖發(fā)生過(guò)程中,NF-?資B活性與動(dòng)物的體重呈正相關(guān)。Obob小鼠的肝臟,脂肪以及淋巴組織中NF-?資B的活性水平上升,循環(huán)細(xì)胞因子的水平增高,這些都說(shuō)明炎癥介質(zhì)與胰島素反抗的關(guān)系。經(jīng)姜黃素治療的肥胖動(dòng)物循環(huán)中細(xì)胞因子IL-1,IL-6水平均明顯下降,由于IL-1和IL-6是NF-?資B活性調(diào)控的重要因子,

15、因此,我們認(rèn)為姜黃素在胞漿內(nèi)有多個(gè)作用靶點(diǎn),通過(guò)對(duì)上述細(xì)胞因子的抑制作用,影響NF-?資B的活性,繼而達(dá)到逆轉(zhuǎn)胰島素反抗和改善胰島素敏感性的作用。在肝臟組織的胰島素信號(hào)檢測(cè)中,胰島素刺激的IRS-1酪氨酸磷酸化的水平明顯上升,AKT的活性也明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果都進(jìn)一步說(shuō)明肥胖小鼠胰島素的敏感性在治療后得到了改善,姜黃素能提高obob小鼠胰島素的敏感性,姜黃素作為一個(gè)免疫調(diào)節(jié)劑用于抑制免疫排斥的同時(shí),對(duì)系統(tǒng)性炎癥也有抑制作用,可能是通過(guò)抑制NF-?資B來(lái)改善胰島素敏感性的。【參考文獻(xiàn)】HUANGHC,JANTR,YEHSF.Inhibitoryeffectofcurcumin,ananti-inf

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