雙水相萃取牛血清蛋白

1、word雙水相萃取牛血清蛋白一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解雙水相系統(tǒng)的成相原理和方法；2.了解制作雙水相系統(tǒng)相圖的方法，加深對(duì)相圖的認(rèn)識(shí)；3.掌握雙水相溶液配制與雙水相萃取的操作；4.掌握分配系數(shù)和萃取收率的計(jì)算方法。二. 實(shí)驗(yàn)原理雙水相系統(tǒng)是由兩種互不相溶的聚合物如聚乙二醇PEG與葡聚糖DX或者互不相溶的聚合物溶液和鹽溶液如PEG與NH42SO4組成。雙水相系統(tǒng)的制備一般是將兩種溶質(zhì)分別配制成一定濃度的水溶液，然后將兩種溶液按照不同的比例混合，靜止一段時(shí)間，當(dāng)兩種溶質(zhì)的濃度超過(guò)某一濃度范圍時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生兩相。相圖是研究雙水相萃取的根底，雙水相形成條件和定量關(guān)系常用相圖來(lái)表示。圖1是典型的高聚物-高聚物雙

2、水相體系的直角坐標(biāo)相圖，兩種聚合物A、B以適當(dāng)比例溶于水就會(huì)分別形成有不同組成的兩相，上相組成用T點(diǎn)表示，下相組成用B點(diǎn)表示，由圖1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲線TCB稱(chēng)為結(jié)線，直線TMB稱(chēng)為系線。結(jié)線上方是兩相區(qū)，下方為單相區(qū)，假設(shè)配比取在曲線上，那么混合后，溶液恰好從澄清變?yōu)榛鞚帷＝M成在系線上的點(diǎn)，分為兩相后，其上下相組成分別為T(mén)和B，T、B量的多少服從相圖的杠桿定律。即T和B相質(zhì)量之比等于系線上MB與MT的線段長(zhǎng)度之比。又由于兩相密度相差很小，故上下相體積之比也近似等于系線上MB與MT線段長(zhǎng)度之比。圖1 A-B雙水相體系相圖雙水相萃取與有機(jī)溶劑萃取原理相似

3、,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配原那么。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于外表性質(zhì)、電荷作用和各種力如憎水性、氫鍵、離子鍵等的存在，使得待別離的物質(zhì)在上、下相中的濃度不同。對(duì)于某一物質(zhì)，只要選擇適宜的雙水相體系，控制一定的條件就可以得到適宜的分配系數(shù)，從而到達(dá)別離純化的目的。本實(shí)驗(yàn)選擇PEG-硫酸銨雙水相系統(tǒng)萃取牛血清蛋白。雙縮脲反響是指蛋白質(zhì)在堿性溶液中與二價(jià)銅離子結(jié)合生成紫色絡(luò)合物的反響。含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反響，蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽鍵，因此有雙縮脲反響，反響生成物顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可以利用雙縮脲反響進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。三、試劑及儀器儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)

4、，電子天平，臺(tái)式高速離心機(jī)，電熱恒溫水浴箱，漩渦混合儀，滴定管，大試管，離心試管(20mL)6只，移液管(1mL,5mL)，試管10mL，注射器10mL試劑：PEG2000，硫酸銨，牛血清蛋白，雙縮脲試劑四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、PEG2000-硫酸銨雙水相體系相圖的測(cè)定1取50%的PEG2000溶液w/v10mL于大試管中；2用40%的硫酸銨溶液w/v裝入滴定管中向大試管滴加，并不斷在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁為止，記錄硫酸銨消耗的體積。參加1mL水使溶液澄清，繼續(xù)用硫酸銨滴定至恰好混濁，重復(fù)7次，記錄每次硫酸銨消耗的體積，計(jì)算每次出現(xiàn)混濁時(shí)體系中PEG和硫酸銨的濃度

5、w/v,并填入表1中。3以硫酸銨的濃度w/v為橫坐標(biāo)，PEG的濃度w/v為縱坐標(biāo)作圖，即得到PEG2000-硫酸銨的相圖。2、利用PEG2000-硫酸銨雙水相體系別離牛血清蛋白1利用雙水相體系別離牛血清蛋白根據(jù)相圖，選擇三個(gè)成相比例，分別參加3mL濃度為10mg/mL牛血清蛋白溶液。攪拌均勻，3500r/min離心5min，靜置分層，分別量取記錄上下相的體積。2蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清蛋白BSA配制成10mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取七支試管分別參加0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5,0.6mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，并用水補(bǔ)足到1mL,然后參加4m

6、L雙縮脲試劑A NaOH 3.5mL, B CuSO4 0.5 mL，充分搖勻后在室溫下放置30min，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照樣。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法，分別取上下相溶液1mL置于兩支試管中，分別參加4mL雙縮脲試劑測(cè)定吸光度。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算出牛血清蛋白的含量和萃取收率。五：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與處理1、 原始數(shù)據(jù)圖片2、PEG2000-硫酸銨相圖制作以及成相比例選擇表一：PEG2000-硫酸銨相圖制作表V初PEG(ml)V水(ml)V硫酸銨(ml)V總(ml)M硫酸銨(ml)CpegC硫

7、酸銨1002.4212.420.96840.26%7.79%1012.9813.981.19235.77%8.53%1023.8615.861.54431.53%9.74%1034.9617.961.98427.84%11.05%1046.0520.052.42024.94%12.07%1057.1622.162.86422.56%12.92%1068.3424.343.33620.54%13.71%1079.5426.543.81618.84%14.38%表二：PEG2000-硫酸銨成相比例選擇CpegCs24.94%12.50%24.94%13.00%24.94%13.20%圖1：PEG2

8、000-硫酸銨相圖及成相比例選擇2、 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作表三：BSA標(biāo)準(zhǔn)吸光度曲線CBSAmg/mlA5400010.06920.12930.17440.22650.27460.328圖2：BSA標(biāo)準(zhǔn)吸光度曲線4、 BSA在雙相中的分布表四：BSA在雙相中的分布及K，R，P的計(jì)算Cpegm/vC硫酸銨m/vVt(ml)Vb(ml)ABStABSbCtm/vCbm/v24.94%12.50%11.306.700.0440.2600.6064.65924.94%13.00%10.907.100.0340.2320.4184.13324.94%13.20%10.507.500.0370.2200.

9、4753.908Cpegm/vC硫酸銨m/vMtmgMbmgM總mgKRP24.94%12.50%6.84831.21238.0600.1301.68782.01%24.94%13.00%4.56029.34633.9060.1011.53586.55%24.94%13.20%4.98429.31134.2950.1211.40085.47% 六：討論本次試驗(yàn)總體進(jìn)行較為順利，標(biāo)曲線性擬合度很高，根據(jù)相圖選擇的成相比例也成功成相，并且由表四可以看出，選擇的三個(gè)成相比例均表現(xiàn)良好的收率均為80%以上。但在計(jì)算上下相總蛋白質(zhì)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)總蛋白質(zhì)量高于參加量，猜想原因如下：1、 同一相中蛋白濃度分布不均：離心導(dǎo)致上下相中的蛋白分布不均，表現(xiàn)在同一相中，偏下層蛋白濃度要高于上層，由于取樣時(shí)下相偏好取底部樣品，上相偏好取頂部樣品，且蛋白質(zhì)多分布于下相，導(dǎo)致出現(xiàn)誤差。2、 操作問(wèn)題:由于未做重復(fù)且樣數(shù)太少，不排除操作過(guò)程中受外來(lái)雜蛋白的影響或吸光度測(cè)定時(shí)的操