苯甲醇對紅細(xì)胞凍干前海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞影響研究

1、    苯甲醇對紅細(xì)胞凍干前海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞影響研究【摘要】  為研究苯甲醇對海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的影響，在4條件下將紅細(xì)胞孵育在濃度分別為10、30、50、100 mmol/L的苯甲醇海藻糖溶液中24小時，用氰化血紅蛋白試劑盒測定海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的溶血率，用硫酸蒽酮法檢測紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度水平。結(jié)果表明：在100 mmol/L苯甲醇海藻糖溶液組，其紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度為72±12.98 mmol/L，與其它各組相比，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.000）；溶血率為17.99±3.75%，與其它各組相比，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.00

2、0）。結(jié)論：苯甲醇可提高海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的負(fù)載率，隨著苯甲醇濃度的升高紅細(xì)胞海藻糖負(fù)載率也提高，100 mmol/L的苯甲醇濃度為可用濃度。 【關(guān)鍵詞】  苯甲醇    Effect of Benzyl Alcohol on Trehaloseloading Red Blood Cells before Lyophilization       Abstract    This study was aimed to evaluate the effect of be

3、nzyl  alcohol on  trehaloseloading red blood cells (RBCs). The RBCs were incubated in 10, 30, 50 and 100 mmol/L concentrations of benzyl alcoholtrehaloe solution at 4 for 24 hours. The hemolysis rate of loaded RBCs was detected by using cyanohemoglobin kit,  the intracellular trehalos

4、e level were assayed by sulfate anthrone method. The results showed that the intracellular trehalose concentration in group with  100 mmol/L benzyl alcohol  was 72±12.98 mmol/L，compared  with that in  groups of 10, 30 and 50 mmol/L, the statistical  difference were sign

5、ificant (p=0.000);  the hemolysis rate of loaded RBCs in group with 100 mmol/L of benzyl alcohol  was 17.99±3.75%, as compared with groups of 10, 30 and 50 mmol/L, the statistical difference  was significant  (p=0.000). It is concluded that benzyl alcohol can enhance the int

6、racellular trehalose concentration. As concentration of benzyl alcohol ascends, the intracellular trehalose concentration increases.100 mmol/L benzyl alcohol may be proper for loading RBCs.    Key words    benzyl alcohol; red blood cell; trehalose    J Ex

7、p Hematol 2007; 15(4):882-884    目前，輸血已成為臨床重要的治療手段之一，據(jù)統(tǒng)計，90%的輸血目的是為了補(bǔ)充紅細(xì)胞。用現(xiàn)有的紅細(xì)胞保存裝備保存費(fèi)用昂貴，不便運(yùn)輸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床急救和突發(fā)事件或?yàn)?zāi)害事故的救援。凍干紅細(xì)胞由于其性能穩(wěn)定，可在常溫下保存，保存時間長，保存費(fèi)用低廉，易于再水化，輸注方便，以固體干粉劑形式存在，體積小，便于運(yùn)輸，克服了目前血液保存的局限性，因此凍干紅細(xì)胞的保存已成為研究的熱點(diǎn)。    凍干紅細(xì)胞的研究已有30多年的歷史，進(jìn)展緩慢.。2004年，Satpathy等1利用滲透非平衡

8、原理和磷脂膜相變相結(jié)合原理將海藻糖導(dǎo)入到紅細(xì)胞內(nèi)。2005年，Satpathy等2將負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞冰凍干燥，再水化后血紅蛋白回收率達(dá)59%。這項(xiàng)研究，為凍干紅細(xì)胞的臨床應(yīng)用邁出了重要一步。2005年，我們在Satpathy實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，改進(jìn)某些實(shí)驗(yàn)方法，用海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞，并進(jìn)行凍干保存研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Satpathy的實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞技術(shù)，提高細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度，是進(jìn)一步提高凍干紅細(xì)胞回收率的關(guān)鍵。苯甲醇為海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的媒介，可大大提高紅細(xì)胞海藻糖負(fù)載率，從而提高凍干紅細(xì)胞血紅蛋白回收率。    材料和方法 &

9、#160;  試劑    海藻糖、蒽酮購自美國Sigma公司，三氯乙酸、濃硫酸分析純購自北京化工廠，氰化血紅蛋白試劑盒購自北京天來公司。苯甲醇 （純度98%，密度1.04535，分子量108.14，毒性LD 50 mg/kg）購自北京化工廠。    儀器    MP4R低溫離心機(jī)（IEC，USA產(chǎn)品），723型分光光度計（上海第三儀器廠產(chǎn)品），SL2數(shù)控層析冷柜（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠產(chǎn)品）。    制備濃集紅細(xì)胞    從解放軍307醫(yī)院

10、取3人份新鮮全血，在4條件下，以329×g離心14分鐘，棄上清及白膜（血小板及白細(xì)胞）；用等量PBS液清洗3遍，用530×g離心10分鐘，棄上清，制成濃集紅細(xì)胞。    海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞    以0.8 mol/L的海藻糖溶液為原液，配制10、30、50、100 mmol/L苯甲醇海藻糖溶液。實(shí)驗(yàn)以苯甲醇溶液濃度為準(zhǔn)，分為10 mmol/L組、30 mmol/L組、50 mmol/L組、100 mmol/L組。將每份血均分于5小組，每組3個樣品，濃縮紅細(xì)胞與苯甲醇海藻糖負(fù)載液以13體積比混勻。每個樣品設(shè)立空白對照，

11、紅細(xì)胞與不同濃度的苯甲醇溶液以13體積比混勻。樣品放置在4 SL2數(shù)控層析冷柜中，負(fù)載24小時。    測定負(fù)載溶血率    用氰化血紅蛋白試劑盒，測定負(fù)載樣品的吸光值，以2 000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，測定上清的吸光值。溶血率為上清吸光值比負(fù)載樣品的吸光值。    細(xì)胞內(nèi)海藻糖量的硫酸蒽酮法測定    負(fù)載后的紅細(xì)胞離心棄上清，用等滲的PBS清洗3遍，加入3倍體積的10%的三氯乙酸混勻,萃取45分鐘,共2次3。離心后收集上清，取上清1 ml,加入濃度為2%的硫酸蒽酮溶液4

12、ml,煮沸10分鐘, 自然冷卻至室溫，在620 nm波長下測定各樣品吸光值。配制不同濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算擬合方程，用擬和方程求出各樣品的海藻糖含量，用溫氏法4測定所萃取紅細(xì)胞的壓積，計算紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖的濃度。    數(shù)據(jù)處理    數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用隨機(jī)區(qū)組方差分析方法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。    結(jié)    果    不同濃度組紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度比較   

13、經(jīng)海藻糖苯甲醇液負(fù)載的紅細(xì)胞， 紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖的濃度是海藻糖負(fù)載組內(nèi)的糖濃度，減去對照組中紅細(xì)胞內(nèi)的糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附表。結(jié)果顯示100 mmol/L組負(fù)載紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度最高，達(dá)72±12.98 mmol/L，與其它各組相比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.000）。紅細(xì)胞來自9個健康獻(xiàn)血者，45個樣本。    不同濃度組紅細(xì)胞溶血率比較    各濃度組溶血率結(jié)果見附表。隨著苯甲醇濃度升高，負(fù)載紅細(xì)胞的溶血率也在增加。在100 mmol/L組，負(fù)載紅細(xì)胞內(nèi)溶血率達(dá)17.99±3.75%，與其它各組相比較，有顯著統(tǒng)

14、計學(xué)差異（p=0.000）。    討    論    紅細(xì)胞在冰凍干燥過程中經(jīng)歷冰凍和干燥兩個過程，目前的紅細(xì)胞凍干技術(shù)主要無法克服干燥對細(xì)胞膜的損傷，其機(jī)制主要是干燥升華過程中，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)水的去除，使組成細(xì)胞膜的磷脂、蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞膜上的蛋白與蛋白、磷脂與蛋白相互作用，造成細(xì)胞膜大片融合破裂，細(xì)胞內(nèi)容物的外漏5。而海藻糖可對抗低溫和干燥對紅細(xì)胞的損傷6。海藻糖是葡萄糖的二聚體，對人體無任何毒副作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)7。干燥狀態(tài)，海藻糖在細(xì)胞膜周圍形成一層水膜，以替代丟失的結(jié)構(gòu)

15、水膜，維持細(xì)胞膜上蛋白、磷脂正常的結(jié)構(gòu)，保持細(xì)胞膜的完整性8。研究表明，海藻糖只有分布于細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)，且細(xì)胞內(nèi)的海藻糖達(dá)到100 mmol/L時，才能在低溫和干燥狀態(tài)下發(fā)揮生物學(xué)保護(hù)作用9。海藻糖是二糖，一般情況下，不能透過細(xì)胞膜，而紅細(xì)胞也不能合成海藻糖，因此如何將海藻糖導(dǎo)入紅細(xì)胞內(nèi)，是紅細(xì)胞冰凍干燥保存的關(guān)鍵所在。    2005年，我們利用滲透非平衡原理和磷脂膜相變相結(jié)合的原理，將海藻糖導(dǎo)入到紅細(xì)胞內(nèi)冰凍干燥保存，并將負(fù)載了海藻糖的紅細(xì)胞功能進(jìn)行一系列評價。在最佳負(fù)載條件下，紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖的濃度只有40 mmol/L，負(fù)載過程中紅細(xì)胞溶血率接近20%，而變

16、形性僅有0.0289±0.00738，負(fù)載海藻糖的紅細(xì)胞冰凍干燥保存后，血紅蛋白回收率約為52%10。細(xì)胞內(nèi)的海藻糖濃度與凍干后紅細(xì)胞血紅蛋白回收率正相關(guān)，因此提高紅細(xì)胞內(nèi)海藻糖負(fù)載率，是優(yōu)化負(fù)載技術(shù)的重要一步。    苯甲醇由于具有防腐、消毒和輕微的麻醉作用，常被用做食品添加劑和注射針劑的稀釋液。少量的苯甲醇進(jìn)入人體后被肝臟分泌的酶催化分解為無毒物質(zhì)而排除體外。目前臨床上所用注射劑中,苯甲醇的安全劑量范圍1%-2%（100 mmol/L換算成百分比濃度小于2%）。苯甲醇還可增加細(xì)胞膜的流動性，改善細(xì)胞膜的通透性，故用來做為海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的媒介。實(shí)驗(yàn)研

17、究，苯甲醇濃度為50-60 mmol/L，可增加細(xì)胞內(nèi)膜的流動性，增大苯甲醇濃度，使細(xì)胞雙層膜流動性增加，但不影響細(xì)胞的黏彈性（變形性），對紅細(xì)胞溶血率影響也很小11。本實(shí)驗(yàn)研究了濃度為10、30、50、100 mmol/L苯甲醇對海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞的影響，隨著苯甲醇濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度逐步增加，苯甲醇濃度為100 mmol/L時，細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度為72±12.98 mmol/L，與其它各濃度組相比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.000）；苯甲醇濃度為100 mmol/L時，溶血率僅為 17.99±3.75%。綜合苯甲醇的安全性、紅細(xì)胞海藻糖負(fù)載率和溶血率三方面的因素，100 mmol/L苯甲醇負(fù)載濃度，是可用的負(fù)載濃度。苯甲醇作為媒介，負(fù)載紅細(xì)胞的方法值得推廣及進(jìn)一步研究。    總之，海藻糖為凍干紅細(xì)胞的保存帶來了新曙光，但海藻糖導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)技術(shù)是紅細(xì)胞冰凍干燥保存成功的關(guān)鍵一步，現(xiàn)有的海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞技術(shù)均有一定局限性。進(jìn)一步改進(jìn)負(fù)載方法，降低負(fù)載過程中紅細(xì)胞的溶血率，提高海藻糖的負(fù)載率，防止負(fù)載過程中紅細(xì)胞的變形性下降，仍是今后研究的焦