T載體與目的基因連接

1、.一. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 T質(zhì)粒載體重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。 DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。 T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 D

2、NA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。 很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會(huì)在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3端加上一個(gè)突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一個(gè)突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對(duì)，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。 連接反應(yīng)的溫度在37時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下

3、粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。 二. 感受態(tài)制備原理細(xì)菌在0C CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)。 三. -半乳糖甘酶顯色反應(yīng)選擇法LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個(gè)基因，可以編碼半乳糖核苷酶。半乳糖核苷酶是由4個(gè)亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解用X-Gal為底物進(jìn)行染色時(shí)，呈藍(lán)色。 現(xiàn)在一些特定的質(zhì)粒（比如pUC/pBS等），常帶有半乳糖核苷酶的調(diào)控序列和半乳糖核苷酶N端146個(gè)氨基酸（肽段）的編碼序列，在這個(gè)編碼序列里

4、還插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）,它并不影響lacZ的表達(dá)。另外，常用的大腸桿菌帶有半乳糖核苷酶C端部分序列（肽段），的編碼序列。在各自獨(dú)立的情況下，這些質(zhì)粒與大腸桿菌各自編碼的半乳糖核苷酶片段都沒有酶的活性。只有當(dāng)攜帶肽編碼信息的克隆載體成功進(jìn)入宿主細(xì)胞，在培養(yǎng)基誘導(dǎo)物IPTG的誘導(dǎo)下，載體質(zhì)粒能夠合成半乳糖核苷酶N端（肽段），這樣就與宿主細(xì)胞合成的半乳糖核苷酶C端部分序列（肽段）互補(bǔ)，形成完整的半乳糖核苷酶活性蛋白。 而當(dāng)外源基因插入到此種載體質(zhì)粒lacZ的多克隆位點(diǎn)后，會(huì)造成lacZ基因不能表達(dá)，從而不能合成半乳糖核苷酶；而對(duì)于空載體，lacZ基因正常表達(dá)，通過互補(bǔ)合成半乳糖核苷酶，分解培

5、養(yǎng)基里的色素底物X-gal，最終形成藍(lán)色的化合物，出現(xiàn)藍(lán)色菌斑。 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：清洗，5個(gè)100ml錐形瓶（外加1個(gè)小的），6副培養(yǎng)皿，3個(gè)小試劑瓶，接種環(huán)，涂布棒 。準(zhǔn)備100ml超純水。溶液:LB300ml(液體50ml+50ml，固體100ml)，0.1mol/L CaCl2 10ml， 100mg/mlAmp 1 ml，20mg/mlX-gal 1 ml， 200mg/ml IPTG 1 ml。大腸桿菌菌液1ml 。感受態(tài)細(xì)胞連接產(chǎn)物4管4 x 5 = 20ul 做4份目的基因T載體T4連接酶10x沖液4 x 4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL滅菌：5個(gè)100ml錐形瓶（外加1個(gè)小的

6、），6副培養(yǎng)皿，3個(gè)小試劑瓶，接種環(huán)，涂布棒，10ml超純水，LB培養(yǎng)基，1.5mlEP管，大小槍頭，過濾用具2副，0.1mol/L CaCl2 實(shí)際配置20mg/ml X-gal X-gal為5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷。用二基甲酰胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml（取0.02gX-gal，用DMF定容為1ml）的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20。X-gal溶液無須過濾除菌。（DMF二甲基甲酰胺; Dimethylformamide; N,N-Dimethylformamide; DMF; C

7、AS：68-12-2理化性質(zhì):無色、淡的胺味的液體。分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相對(duì)密度0.9445(25)。熔點(diǎn)-61。沸點(diǎn)152.8。） 溶于DMSO，溶解度可達(dá)20mg/ml。也溶于DMF 溶于DMSO，溶解度可達(dá)20mg/ml。也溶于DMF 200mg/ml IPTG 在0.8ml蒸餾水中溶解0.2g IPTG后，用蒸餾水定容至1ml，用0.22m濾器過濾除菌，貯存于-20。 LB培養(yǎng)基： 配制每升培養(yǎng)基,應(yīng)該在950 ml去離子水中加入:胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解.用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.3.用去離子水定容至

8、1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min.（ 100mlLB培養(yǎng)基加入1.5g瓊脂粉為固體培養(yǎng)基） 0.1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化鈣固體定容至10ml Amp（100mg/ml）：溶解0.1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至1ml，用0.22m濾膜過濾除菌. 實(shí)驗(yàn)過程（一）.目的基因片段與載體連接器材 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，臺(tái)式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。 試劑 T 載體，T4 DNA 連接酶，連接酶緩沖液，無菌dd Water 。操作步驟 PCR產(chǎn)物與T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)

9、定在1416C。 （2） 取4個(gè)滅菌的200ul微量離心管，加入：（需要調(diào)整） 4ml 目的基因 ；1ml T載體 ；0.5ml T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 連接酶緩沖液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，總量10ml 體系。 （3） 述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14C干式恒溫儀（或14C水中）中保溫過夜（12-16h）。 （4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4C冰箱備用。 （二）. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備細(xì)菌轉(zhuǎn)化 儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，臺(tái)式

10、冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過濾器 試劑： E. coli菌種，LB培養(yǎng)基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無菌dd Water ，LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌dd water，IPTG，X-gal。 步驟（1） 在超凈工作臺(tái)中，將1ml大腸桿菌菌液加入100ml LB液態(tài)培養(yǎng)基（不含抗菌素），37搖床培養(yǎng)過夜。 （2） 取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37下250r/min搖床培養(yǎng)23h

11、，測(cè)定OD590為0.350.4左右（0.40.6，細(xì)胞數(shù)108/mL，此為關(guān)鍵參數(shù)?。＃ㄗ⒁猓捍瞬綋u菌的時(shí)候，要有一管不加菌的LB培養(yǎng)液同時(shí)搖菌） （3） 將1ml菌液加入到4支1.5mL預(yù)冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm離心5min。 （4） 將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。 （5） 4，5000rpm離心5min，棄上清液后，用100L 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置2h，可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或立即放入-4攝氏度冰柜中保藏。

12、 （6） 事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42。 （7） 從-70 超低溫冰柜中取出一管（100L）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴510min。 （8） 加入5L連接好的質(zhì)粒混合液（DNA含量不超過100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。 （9） 輕輕搖勻后插入42水浴中90s進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3min。 （10） 在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入300L LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37震蕩1h。 （11） 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液200L，分別滴到含合適抗菌素（Amp 100ug/L）的固體LB平板培養(yǎng)皿中，再在平板上滴加40

13、L 20mg/ml X-gal，7L 200mg/ml IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：一個(gè)不含抗生素作為對(duì)照組，玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。）。 （12） 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37恒溫培養(yǎng)箱中30min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37恒溫培養(yǎng)箱過夜。 （13） 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。 （14） 觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。 （三）. 轉(zhuǎn)化克隆的篩選

14、和鑒定器材 旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。 試劑LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。 操作步驟 方法一：快速PCR篩選法（1） 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取4個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標(biāo)記編號(hào)。 （2）在0.2ml PCR 微量離心管中配制25l反應(yīng)體系

15、。 dd water 16l 10PCR buffer（不含MgCl2）2.5l 25mM MgCl2 1.5l 2.5mmol/L dNTP 2l（每種dNTP終濃度0.2mM） 10mol/L Primer1 1l（12.525pmoles） 10mol/L primer2 1l（12.525pmoles） 模板質(zhì)粒 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗 Taq酶 0.5l（1.5u） 總體積 25l （2）根據(jù)廠商的操作手冊(cè)設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序（本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)置為WZ）： 945min 941min 601min 721min50sgoto29 times 7210min （2） PCR結(jié)束后，取10l產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時(shí)比對(duì)）。觀察膠上是否有預(yù)計(jì)的主要產(chǎn)物帶。 （3） 按照編號(hào)找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒 （4） 提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對(duì)比電泳，以進(jìn)一步確認(rèn)。 方法二：提質(zhì)粒再PCR或酶切鑒定 （1）在超凈工作臺(tái)中取3支無菌搖菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素），用記號(hào)筆寫好編號(hào)。 （2）在超凈工作臺(tái)中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基 上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mL LB（含5