無泵驅動體外膜肺治療犬急性呼吸衰竭時的內皮素

1、無泵驅動體外膜肺治療犬急性呼吸衰竭時的內皮素    【關鍵詞】 呼吸功能不全；,內皮素 Dynamic change of endothelins1 in plasma and lung tissue of dogs with acute respiratory failure treated with pumpless extracorporeal membrane oxygenation 【Abstract】 AIM: To study the dynamic change of the endothelins1 (ET1) in plasma an

2、d lung tissue of dogs with acute respiratory failure (ARF) treated by bilateral femoral arteriovenous extracorporeal membrane oxygenation （bAVECMO）. METHODS: A total of 10 ARF dog models were treated by the bAVECMO. Right atrium blood and lung tissue were collected at different time (before experime

3、nt, when models were established, 1, 2, 3, 4 h during ECMO). ET1 was detected dynamically by radioimmunological and immunohistochemical methods during bAVECMO. RESULTS: ET1 content in plasma was descendent from the original level （the moment when the models were completed）， went back at 1 h and peak

4、ed at 2 h, then it descended. ET1 content in lung homogenate get to the peak at 2 h and then started to decrease. The statistical analysis showed ET1 contents in plasma or lung tissue changed significantly between pre and postECMO. CONCLUSION: The bAVECMO has a positive significance in the early tre

5、atment of ARF. 【Keywords】 respiratory insufficiency； endothelins1；bilateral femoral arteriovenous extracorporeal membrane oxygenation 【摘要】 目的: 觀察雙側股動脈股靜脈無泵驅動體外膜肺（bAVECMO）治療急性呼吸衰竭犬,血漿及肺組織內皮素1（ET1）的表達變化. 方法: 10只犬在建立急性呼吸衰竭模型情況下給予bAVECMO治療. 分別于實驗開始前、模型建立完成時、轉流開始后1，2，3，4 h取肺組織及血漿. 應用放免、免疫組化,觀測bAVECMO期間血漿

6、、肺組織勻漿ET1變化, 及與組織損傷的關系. 結果：犬ARDS模型血漿ET1含量在原有基礎上（模型完成時）先降低，1 h后開始回升，2 h達到高值，之后緩慢下降；肺組織勻漿ET1含量轉流2 h達到高值，之后緩慢下降. 統(tǒng)計分析表明勻漿和血漿各自ET1的均數(shù)在轉流前后差異有統(tǒng)計學意義. 肺組織勻漿ET1轉流3 h與4 h差異無統(tǒng)計學意義. 結論：對于急性呼吸衰竭bAVECMO的早期治療有積極意義. 【關鍵詞】 呼吸功能不全； 內皮素1； 雙側股動脈股靜脈無泵驅動體外膜肺 0引言 在對急性呼吸衰竭(ARF)和急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)的研究中，人們發(fā)現(xiàn)ARF，ARDS時內皮素1 mRNA表達

7、顯著增強，說明ET1參與了急性肺損傷的病理生理過程. 在對ARF，ARDS的治療中無泵驅動體外膜肺輔助(AV)轉流技術(AVECMO)由于其有效并對血液有形成分破壞輕等優(yōu)點，已被應用于臨床1. 在應用AVECMO轉流中，國外均采用單側股動脈股靜脈ECMO轉流，在臨床中表現(xiàn)了一定的不足，如引流量不夠大，影響了AVECMO的效果；但如應用大口徑動脈插管來增加動脈引流，則會嚴重影響插管側下肢血液供應等. 本項研究首次采用雙側股動脈股靜脈無泵驅動體外膜肺（bAVECMO）轉流技術，通過治療犬急性呼吸衰竭模型，觀察血漿、肺組織ET1的變化，為臨床提供參考依據(jù). 1對象和方法 1.1實驗動物的準備選擇健康

8、成年家犬10只，雌雄不限，體質量為1835（平均23.4±4.7) kg,應用35 g/L的苯巴比妥100 mg/kg進行腹腔注射行全身麻醉，待犬意識不清時，行氣管插管與麻醉機連接. 常規(guī)消毒鋪巾，分別解剖犬左、右兩側的股動脈及股靜脈，全身肝素化靜脈注射肝素，用量為1 mg/kg體質量，股動脈，股靜脈上、下兩端分別套絲線，結扎下端的股動脈、股靜脈. 阻斷股動脈、股靜脈上端，在阻斷與結扎血管的中下端，切開血管. 根據(jù)動、靜脈內徑的大小選擇不同型號的PVC動、靜脈插管，插管后結扎固定以防止脫出，常規(guī)縫合皮下、皮膚，防止傷口處滲血. 將動、靜脈插管與bAVECMO裝置連接. 右側胸部開胸沿

9、著第4肋間進胸，切開心包分別將心包固定在切口邊緣，主動脈根部置入測壓針管及測壓裝置，將此裝置與飛利浦有創(chuàng)血壓、心率動態(tài)監(jiān)護儀連接. 當bAVECMO轉流時，通過bAVECMO端口應用1000 mL/L氧氣，其用量為(1.2±0.4) L/min. 1.2標本采集建立循環(huán)后，根據(jù)不同的轉流時間收集標本. 在體外循環(huán)開始前，經(jīng)胸部切口取右肺下葉少許組織（10 mm×10 mm），置液氮罐待檢測. 制作呼吸衰竭動物模型進行試驗. 應用潘克羅寧（Pancuronrum）（一般情況下0.10.2 mg/kg體質量），20 kg左右的犬首次劑量為4 mg，以后每30 min.左右追加2

10、 mg使呼吸完全消失. 通過麻醉機調節(jié)呼吸頻率和潮氣量（犬在安靜狀態(tài)下潮氣量如體重在16.430.5 kg，其潮氣量多在251432 mL）. 采用血氣分析儀測定犬動脈血pH值、動脈血氧分壓、動脈血氧飽和度及動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）值，當達到呼吸衰竭指標時，經(jīng)右心房抽血10 mL于注射器內，立即密封置冰盒待檢. 另經(jīng)胸部切口取右肺下葉少許組織（10 mm×10 mm），置冰盒后待檢測. 開始bAVECMO轉流實驗后1，2，3，4 h，分別經(jīng)右心房抽血10 mL，胸部切口取右肺下葉少許組織（10 mm×10 mm），置液氮罐待檢測. 1.3樣品制備及測定方法血漿及肺組

11、織勻漿ET1含量測定:采用SN 695型全自動計數(shù)器(上海原子核所，放射免疫藥盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所),以放射免疫法測定標本ET1含量. 內皮素1含量的免疫組化分析，摘取肺臟用甲醛固定,制作石蠟切片,HE染色,觀察肺臟光鏡下病變;并用鏈霉菌親生物素蛋白過氧化物酶免疫組化染色法(SP方法)進行免疫組化染色(按試劑盒說明書操作). 統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，血漿及肺組織ET1的組內分析采用重復測量方差分析. P<0.05有統(tǒng)計學意義. 2結果 2.1肺組織內皮素濃度如表所示血漿ET1含量在原有基礎上（模型完成時）先降低，1 h后開始回升，2 h達到高值，之后緩

12、慢下降；肺組織勻漿ET1含量轉流2 h達到峰值，之后緩慢下降. 重復測量方差分析表明勻漿和血漿各自ET1的均數(shù)在轉流前后有顯著差異. 肺組織勻漿ET1轉流3 h與4 h已無顯著差別（表1）.表1血漿及肺組織ET1在轉流期間變化（略）    2.2免疫組化結果結果評定以細胞漿或細胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀，且著色明顯高于背景或背景不著色而細胞著色者為表達陽性（圖1）.免疫組化染色呈陽性反應（棕黃色著色）的部位：小細支氣管壁、終末細支氣管壁上皮細胞及周圍平滑肌細胞胞漿和胞膜；小血管壁周圍平滑肌細胞胞漿、纖維組織和結締組織；巨噬細胞胞漿.  &#

13、160; 與術前比較，術前部分細支氣管壁上皮細胞胞漿內和胞膜可見弱陽性表達，血管壁周圍和巨噬細胞中表達陰性. 造模完成后及轉流期間氣管壁及周圍、血管壁周圍明顯陽性表達，少數(shù)巨噬細胞中陽性表達，其中以氣管壁及周圍變化最明顯. 2 h之后各時間點陽性表達范圍和強度未見明顯變化（圖1）. 與術前組織對比，造膜完成后肺組織可見散在淤血、肺泡壁間隔輕微增厚等組織輕微損傷現(xiàn)象，未見組織紊亂、斷裂等嚴重組織損傷改變. 3討論 在對于ARF，ARDS治療技術中，ECMO是一項具有重要意義的治療方法. 但傳統(tǒng)的ECMO方法有諸多缺點，如在持續(xù)使用有泵驅動轉流技術ECMO治療方面，Macdonald等2

14、研究發(fā)現(xiàn)頑固性肺高壓新生兒血中內皮素明顯高于正常嬰兒. 采用非ECMO治療，患兒隨著癥狀改善血中內皮素在35 d下降，而持續(xù)使用有泵驅動轉流技術ECMO治療的患兒血中內皮素卻持續(xù)增高. 表明在ECMO治療時，內皮素增加的主要原因是血泵影響的緣故. 通常國內使用人工膜肺對于呼吸疾病的治療，往往被限制于病情危重無法控制,即患者的肺已無法完成維持生命所必須的氣體交換的危重病例,這使得多數(shù)危重病例在使用ECMO治療前其實已喪失治療機會，我們認為這導致了ECMO應用死亡率有所夸大. Ancel等3研究認為，ECMO能提高兒童的生存率，但在不可逆的細胞損傷產(chǎn)生前應用，即早期應用是其提高生存率的關鍵所在.

15、bAVECMO避免了傳統(tǒng)ECMO治療方法的諸多缺點,呼吸衰竭動物模型肺組織內皮素1的表達研究對其應用推廣具有意義. 內皮素（ET）作為機體在缺氧、應激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種致?lián)p傷因子為研究者所重視. 研究認為4ET1是缺氧致肺血管收縮的支撐因素，單純缺氧40 min后，血漿ET1水平有明顯升高. 目前認為肺是ET1的主要生物合成和代謝場所，由203個氨基酸組成的內皮素前體原（PreproET1,PPET1）是其原始物質. 由于肺大量釋放和代謝ET1，ET1釋放或消耗量明顯高于外周血含量，而肺循環(huán)是機體循環(huán)的重要組成部分，所以ET1的釋放能夠較快地從外周血中體現(xiàn)出來，這使得兩者間ET1變化趨同. 在研

16、究中我們對血漿和肺組織勻漿ET1測定的結果進行了分析，血漿和肺組織勻漿ET1水平自轉流1 h后均呈正相關. 表明轉流1 h后血漿ET1含量變化能夠反映肺組織ET1含量變化. 因此在臨床上可通過測定血漿內ET1含量來反映肺組織勻漿中ET1含量的變化，以便對bAVECMO治療作出評價，對治療方案和對bAVECMO的使用進一步改進. 實驗研究發(fā)現(xiàn)犬急性呼吸衰竭模型肺組織勻漿、血漿ET1含量，在原有基礎上（模型完成時）先降低，究其原因主要為bAVECMO轉流早期由于預充液使體內液體量增加；血流重新分配致肺的血流減少. 這些原因使患者體內的總液體量增加，體重增加，組織水腫存在，血漿ET1相對減少. 而缺

17、血、缺氧致肺部炎癥組織灌注不足等情況下，肺組織生成ET1實際增多，內皮細胞和肺泡壁的損傷使ET1滅活下降，導致肺組織內ET1升高. 同時，缺氧激活多種血管活性物質，如血栓素A2，血管緊張素等，而這些物質的釋放又進一步刺激內皮細胞釋放ET15. 所以，肺組織及血漿ET1含量在以后的研究中逐漸升高. 但由于bAVECMO的早期應用（細胞不可逆損傷產(chǎn)生前早期應用）減少了ET1的進一步釋放，使其表達在表現(xiàn)出升高后減少. 免疫組化結果顯示，術前部分細支氣管壁上皮細胞胞漿內和胞膜可見ET1弱陽性表達，血管壁周圍和巨噬細胞中表達陰性. 造模完成后及轉流期間氣管壁及周圍、血管壁周圍明顯陽性表達，少數(shù)巨噬細胞中

18、陽性表達，其中以氣管壁及周圍變化最為明顯. 轉流2 h之后各時間點陽性表達范圍和強度未見明顯變化，這與我們放免試驗結果相一致. 在研究中，有理由認為ET1在肺臟中的表達可能隨bAVECMO的轉流進一步下降. 要進一步證實，須bAVECMO的長期轉流試驗來進行研究. 但對于急性呼吸衰竭而言，bAVECMO的早期治療可被認為具有積極意義. 【參考文獻】 1Liebold A, Rang CM, Philippi A, et al. Pumpless extracorporeal lung assistexperience with the first 20 casesJ. Euro J Cardiothorac Surg,2000,17:608-613. 2Naoki K，Hiroshi H，Daniel IS，et al. Cardiopulmonary bypass produces greater pu