溫和化學(xué)滲透法破碎酵母細胞的研究

1、    溫和化學(xué)滲透法破碎酵母細胞的研究        摘要對溫和化學(xué)滲透法破碎酵母細胞以釋放乙醇脫氫酶(ADH)的可能性進行了研究；研究了溫和化學(xué)滲透劑（甘氨酸、丙氨酸）進行細胞破碎時，其破碎時間、化學(xué)滲透劑濃度、溶液pH值、添加表面活性劑（TritonX-100）的濃度對細胞破碎率及目的蛋白質(zhì)的影響；建立了細胞破碎的動力學(xué)方程。關(guān)鍵詞溫和化學(xué)滲透劑；酵母細胞；乙醇脫氫酶 Disrupting the Yeast Cell by Mild Chemical Permeabi

2、lizationLi XialanCai EnuoZeng Mingrong（Overseas Chinese University,Quanzhou 362011）AbstractA study is made on the possibility of mild chemical pereabilization agents,such as glucine and alanine ,disrupting the cell to release alcohol dehydrogenase. Disruption time, mild chemical permeabilization age

3、nts concentration , pH of the solution ,surfactant concentration were studied ,which affects the disruption cell efficiency and protein recovery .The protein release kinetics of a permeabilization process using glycine and alanine were characterized. Key Words Chemical permeabilization， Cell disrupt

4、ion， Glycine ， Alanine80年代初，重組DNA技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，生物技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍，實驗室規(guī)模的生物產(chǎn)品愈來愈多，但目前生物技術(shù)的下游加工過程卻很薄弱，很大程度上制約了生物產(chǎn)品的工業(yè)化。很多生物產(chǎn)品屬胞內(nèi)物質(zhì)，分離提純這類產(chǎn)物時，必須將細胞壁破碎使產(chǎn)物得以釋放。因此，細胞破碎是提純胞內(nèi)產(chǎn)物的關(guān)鍵性步驟。目前，細胞破碎的方法很多1，有機械法（如珠磨法、高壓勻漿法、超聲波法）和非機械法（如溶酶法、滲透壓沖擊、干燥法、化學(xué)滲透法）。本課題研究的化學(xué)滲透法是有選擇性地加入某些化學(xué)試劑，改變細胞壁或膜的通透性，從而使胞內(nèi)的物質(zhì)有選擇性地滲透出來的一種方法。化學(xué)滲透法過去主要用來

5、檢測胞內(nèi)酶的活性。用于釋放胞內(nèi)物質(zhì)的研究近年引起人們的關(guān)注，但國內(nèi)外有關(guān)這方面的研究進展緩慢，國內(nèi)外的報道集中在有機溶劑、抗生素、表面活性劑、螯合劑、變性劑等化學(xué)試劑進行細胞破碎2-4。這些化學(xué)試劑在改變細胞壁或細胞膜的通透性的同時，胞內(nèi)的目的生化物質(zhì)易變性。本課題研究的工作之一就是尋找溫和化學(xué)滲透劑，使之既能使細胞破碎，又能維持胞內(nèi)目的生化物質(zhì)的高活性。本文首次提出溫和化學(xué)滲透劑的概念，初步研究溫和化學(xué)滲透劑破碎細胞的可能性。由于我國生產(chǎn)的破碎細胞的設(shè)備效率較低，目前我國絕大多數(shù)胞內(nèi)酶均依靠進口，因此研究適合我國國情的細胞破碎方法是必要的。乙醇脫氫酶在臨床分析，科學(xué)研究及生產(chǎn)某些光學(xué)活性物質(zhì)

6、(如R-2-OH-苯丁酸及鹽類)都有廣泛的應(yīng)用。理論上可以作為治療急性醇類中毒的藥物。本文以干釀造酵母為研究對象，破碎干釀造酵母以釋放目的蛋白乙醇脫氫酶。1實驗材料1.1實驗材料干釀酒酵母細胞（Saccharomyces cerevisae），輔酶 （上海浦江應(yīng)用生物化學(xué)研究所），牛血清蛋白（上海長陽生化制藥廠），考馬斯亮蘭G-250 （Fluka進口分裝），甘氨酸（上海南翔試劑廠），丙氨酸（上海試劑三廠）。1.2實驗設(shè)備離心機800型（上海器械廠），分光光度計721（上海第三分析儀器廠），光柵分光光度計722（上海第三分析儀器廠），酸度計pHT-P型（中國上海大中分析儀器廠）。1.3實驗方法

7、552實驗結(jié)果2.1甘氨酸及丙氨酸破碎細胞21.1甘氨酸及丙氨酸破碎細胞的破碎時間對蛋白質(zhì)濃度及ADH活性的影響將干酵母細胞浸泡后，加入pH8.0、2.00mol/L的甘氨酸或pH8.0、1.00mol/L的丙氨酸，不加TritonX-100，破碎時間對蛋白質(zhì)濃度及ADH活性的影響見1。ADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala systemFig 1Effect of disruption time on ADH activity

8、and protein releaseADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala systemFig 2Effect of chemical permeabilization agentsconcentration on ADH activity and protein release213pH值對蛋白質(zhì)濃度及ADH活性的影響將干酵母細胞浸泡后，加入不同pH值的2ml/L甘氨酸(破碎時間4h)或1ml/L的丙氨酸溶液(破碎時間6h)，

9、不加Triton X-100,pH對蛋白質(zhì)濃度及ADH活性的影響見3。ADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala systemFig 3Effect of pH on ADH activity and protein releaseADH activity of Gly system,+ADH activity of Ala systemprotein conc of Gly system,?protein conc. of Ala

10、systemFig 4Effect of TritonX-10 concentration on ADH activity and protein release從4可知，不論是甘氨酸還是丙氨酸，隨著TritonX-100濃度的增大，蛋白質(zhì)濃度和ADH活都先增大后減小，TritonX-100濃度達某一濃度時（甘氨酸：5.00%，丙氨酸：7.00%），蛋白質(zhì)濃度與ADH活性都有一最大值（甘氨酸中986.35U/ml,丙氨酸中1198.98U/ml）。當(dāng)TritonX-100濃度大于某一濃度時（甘氨酸中5.00%，丙氨酸中7.00%），在液相中出現(xiàn)混濁，經(jīng)離心后得到白色沉淀。2.2傳統(tǒng)化學(xué)滲透劑(

11、鹽酸胍、TritonX-100)與溫和化學(xué)滲透劑(甘氨酸、丙氨酸)對細胞破碎效率的比較將干酵母細胞浸泡后，單獨加入pH8.00, 2.00mol/L的鹽酸胍溶液,2.00ml/L的TritonX-100溶液、2.00ml/L的甘氨酸溶液、1.00mol/L的丙氨酸溶液破碎細胞，細胞破碎情況的比較見5。中橫坐標(biāo)為實驗條件下可達到的最大蛋白質(zhì)濃度及ADH活性。中縱坐標(biāo)為達到指標(biāo)最大值的細胞破碎時間。5蛋白質(zhì)濃度的最大值以鹽酸胍破碎最高，甘氨酸次之，TritonX-100最低。5ADH活性的最大值以丙氨酸最高，甘氨酸次之，鹽酸胍最低。中清楚顯示，鹽酸胍破碎細胞的效率最高，但同時造成ADH變性失活，而

12、甘氨酸和丙氨酸在破碎細胞的同時，能維持ADH的高活性，其中又以丙氨酸效果更好。ADH activity,protein conc,A:guanidine-HCl system,B:Gly system,C:Ala system,D:triton X-100 systemFig 5The comparison of several chemical permeabilization agents disrupting the cell2.3細胞破碎的動力學(xué)方程的建立化學(xué)滲透法破碎細胞的主要過程包括：A.化學(xué)滲透劑從主體濃度擴散到細胞表層；B.化學(xué)滲透劑從細胞表層擴散到細胞內(nèi)；C.化學(xué)滲透劑與細胞

13、壁和細胞膜反應(yīng)以及胞內(nèi)蛋白的釋放；D.胞內(nèi)蛋白向胞外擴散；E.化學(xué)滲透劑從細胞壁外擴散到主體濃度。由于化學(xué)滲透劑分子量小，擴散阻力不大；細胞內(nèi)壓較高，蛋白質(zhì)向外擴散較快。由于攪拌化學(xué)滲透劑在液相中的擴散速度很快，故可認(rèn)為A、B、D、E四步為非控制步驟?；瘜W(xué)破碎過程可簡化為一級動力學(xué)模型，B為控制步驟。其中，P為釋放總蛋白，Pm為釋放總蛋白最大值，k為蛋白釋放速度常數(shù)，t為破碎時間。當(dāng)t=0時，P=Po；則上式積分得：P=(Po-Pm)exp(-kt)+Pm對實驗數(shù)據(jù)進行非線性回歸得到的回歸方程式如表1和6。Explain:(1) left fig is Gly system,right fig

14、 is Ala system(2) spot is experiment spot, curve is protein-release regression curveFig 6The protein release from the cell treated with chemical permeabilization agents against disruption timeTab 1The protein release kinetics equation of disruption process using chemical permeabilization agentsPerme

15、abilizationagentsRegression equationCorrelationStandarderrorGlyP=19.96+(14.93-19.96)exp(-0.2169x)0.99750.1144AlaP=19.25+(14.78-19.25)exp(-0.1479x)0.99540.1207從表1和6可知:溫和化學(xué)滲透劑（甘氨酸、丙氨酸）破碎細胞時蛋白質(zhì)釋放的動力學(xué)理論模型與實驗數(shù)據(jù)吻合較好。 3討論1) 化學(xué)滲透劑的極性問題酵母細胞壁的主要成分為葡聚糖與甘露糖以及蛋白質(zhì)等。酵母細胞壁最里層是由葡聚糖的細纖維部分組成，它構(gòu)成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀。覆蓋

16、在細纖維上的是一層糖蛋白，再外層是由1,6-磷酸二酯鍵共價連接而成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的甘露聚糖，在甘露聚糖的內(nèi)部有甘露聚糖-酶的復(fù)合物，它可以共價連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，也可以不連接。破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。當(dāng)用甘氨酸、丙氨酸等分子量較小的非極性R基氨基酸進行了破碎酵母細胞時,甘氨酸的側(cè)鏈中含有不解離的弱極性基-H，能與-N、-P、-O形成氫鍵，丙氨酸的側(cè)鏈中含有疏水基-CH3，不論是甘氨酸還是丙氨酸其分子中的NH+3、-COO極性都很強。甘氨酸、丙氨酸破碎細胞的機理可能是因為小分子的甘氨酸、丙氨酸更易滲透到酵母細胞壁外側(cè)的甘露聚糖孔隙間，通過氫鍵、范德華引力、靜電引力等

17、化學(xué)親和力改變甘露聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而改變細胞壁和細胞膜的通透性，使得胞內(nèi)蛋白得以釋放。2)破碎時間對蛋白質(zhì)濃度及ADH活性的影響一般說來，甘氨酸及丙氨酸破碎細胞的時間越長，被破碎細胞的數(shù)量必然越多，即液相中的蛋白質(zhì)的濃度越高。甘氨酸與丙氨酸相比，在相同的破碎時間里，液相的蛋白質(zhì)濃度相差不大，但甘氨酸破碎細胞時，ADH的活性卻高于丙氨酸破碎細胞的ADH活性。究其原因，我們認(rèn)為甘氨酸的PI=5.97，丙氨酸PI=6.02，兩者的PI值都相近，pH值相同時，其帶電情況幾乎一致，因此它們的帶電狀況對細胞的破碎影響趨勢相同；若考慮到甘氨酸及丙氨酸除側(cè)鏈基團不相同外，其余基團相同，因此甘氨酸及丙氨酸破碎細

18、胞時ADH的活性相差很大或許與甘氨酸、丙氨酸側(cè)鏈基團極性大小有關(guān)，其側(cè)鏈基團極性大小不同，對ADH的高級結(jié)構(gòu)影響是不一樣的。有關(guān)原因需要進一步探討。3) 甘氨酸及丙氨酸濃度對蛋白質(zhì)濃度及ADH活性的影響一般說來化學(xué)滲透劑濃度越大，酵母細胞周圍有更多的化學(xué)滲透劑分子，滲透到細胞壁間的分子數(shù)量更多，增加了甘露聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的破壞程度，使得更多的胞內(nèi)蛋白滲出。但化學(xué)滲透劑的濃度過大，會破壞了ADH的高級結(jié)構(gòu)，使得蛋白質(zhì)及ADH活性都下降。4) pH值對蛋白質(zhì)濃度及ADH活性的影響實驗結(jié)果表明pH值的變化，對細胞破碎率影響較小。我們認(rèn)為在pH>6.0時，甘氨酸和丙氨酸都呈帶負電的離子狀態(tài)，因此在本

19、實驗的pH條件下，甘氨酸及丙氨酸對細胞破碎的影響趨勢是相同的。在此實驗條件下，pH值主要影響了ADH的高級結(jié)構(gòu),ADH在 pH 8.8時最穩(wěn)定5,pH偏酸或偏堿,都使ADH的高級結(jié)構(gòu)遭到破壞,造成ADH活性下降。5) 加入TritonX-100對破碎細胞及ADH活性的影響TritonX-100是一種非離子表面活性劑，它具有親水性部分和憎水性部分，溶于水后，低濃度時，其分子分散在水中，似真溶液一般，濃度增至某一值，其分子間的距離不斷縮短，遂借烴鍵之間的引力，分子便會相互吸引而形成聚集體，此聚集體被稱為“微團”。在“微團中”TritonX-100分子的憎水基朝內(nèi)，親水基朝外，微團把疏水性物質(zhì)“溶解

20、”在自己的憎水部分中，TritonX-100“微團”能溶解細胞壁上的蛋白質(zhì)，因而具有破碎細胞壁的能力6。因此，在甘氨酸或丙氨酸中添加TritonX-100則大大增加細胞破碎率。但TritonX-100濃度大于某一濃度時，其造成了蛋白質(zhì)的變性失活，使得蛋白質(zhì)濃度和ADH活性都下降,從可知此時ADH活性受TritonX-100影響很大。此外，實驗過程發(fā)現(xiàn)TritonX-100單獨使用時，液相中蛋白質(zhì)含量及ADH活性均不高，但與甘氨酸及丙氨酸相結(jié)合使用時，無論是蛋白質(zhì)濃度還是ADH活性均較高。這可能是TritonX-100“微團”既能溶解疏水性物質(zhì)，又能保護ADH的高級結(jié)構(gòu)（與“反膠束”萃取原理相同）。4結(jié)論與傳統(tǒng)化學(xué)滲透劑相比，甘氨酸和丙氨酸在破碎細胞的同時，又能維持ADH的高活,這對釋放胞內(nèi)產(chǎn)物,尤其對胞內(nèi)具有生物活性的生