雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗(Vero細胞)

1、 雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗（Vero細胞）Shuangjia Shenzonghezheng Chuxuere Miehuoyimao （Vero Xibao）Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome Bivalent Vaccine (Vero Cell), Inactivated本品系用型和型腎綜合征出血熱（簡稱出血熱）病毒分別接種Vero細胞，經培養(yǎng)、收獲、病毒滅活、純化，加入氫氧化鋁吸附后制成。用于預防I型和II型腎綜合征出血熱。1 基本要求生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符 “凡例”的有關要求。2 制造 2.1生產用細胞生產用細

2、胞為Vero細胞。細胞的管理及檢定應符合 “生物制品生產和檢定用動物細胞基質制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。各種子批代次應不超過批準的限定代次。取自同批工作細胞庫的1支或多支細胞管，經復蘇擴增后的細胞僅用于一批疫苗的生產。細胞制備取工作細胞庫的1支或多支細胞管，經復蘇擴增至接種病毒的細胞為一批。將復蘇后的單層細胞消化，分散成均勻的細胞，加入培養(yǎng)液后混合均勻，置37培養(yǎng)3-4天，成均勻單層細胞。2.2毒種名稱及來源生產用毒種為分離自腎綜合征出血熱病人血清中的I型出血熱病毒SD9805株和II型出血熱病毒HB9908株， 或其他經批準的出血熱I型和II型毒株。病毒種子批的建立應符合現行版中國藥典三部 通則中

3、“生物制品生產檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。出血熱毒種SD9805株和HB9908株的原始種子批代次均為鼠腦第3代。原始種子批毒種經Vero細胞傳代分別建立主種子批和工作種子批。I型出血熱毒種SD9805株主種子批應不超過第9代，工作種子批應不超過第14代；II型出血熱毒種HB9908株主種子批應不超過第8代， 工作種子批應不超過第13。種子批毒種的檢定主種子批應進行以下全面檢定，工作種子批應至少進行.1-4項檢定。.1鑒別試驗將各型毒種10倍系列稀釋，每個稀釋度分別與已知的相應型別的出血熱病毒血清參考品等量混合，同時以正常兔血清做空白對照。分別置37水浴90分鐘，接種Vero-E6單層細胞，于

4、37 CO2濃度為5%條件下培養(yǎng)10-14天，以免疫熒光法測定，中和指數應大于1000。.2病毒滴定將各型毒種10倍系列稀釋，取適宜稀釋度接種Vero-E6細胞，于33培養(yǎng)10-12天，采用免疫熒光法進行測定，病毒滴度均應不低于7.0lgCCID50/ml。.3無菌檢查依法檢查（附錄XII A），應符合規(guī)定。.4支原體檢查依法檢查（附錄XII B），應符合規(guī)定。.5病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C），應符合規(guī)定。.6免疫原性檢查取主種子批毒種制備雙價原疫苗，接種2kg左右的白色家兔（家兔血清出血熱病毒抗體檢測應為陰性），每批4只，后腿肌肉注射1.0ml，7天后以同法再免疫一次。第一次免

5、疫后4周采血分離血清，用空斑減少中和試驗測中和抗體，中和用病毒為出血熱病毒76-118株和UR株，同時用血清參考品作對照（應符合參考血清效價的標示值），4只家兔的I型和II型出血熱中和抗體滴度均應不低于1：10。2.2. 4毒種保存凍干毒種保存于-20以下，液體毒種應置-60以下保存。2.3單價原液細胞制備按項進行。培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為含10%滅能新生牛血清的MEM。新生牛血清的質量應符合現行版中國藥典三部的要求。人血白蛋白的質量應符合現行版中國藥典三部的要求。對照細胞病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C），應符合規(guī)定。病毒接種、培養(yǎng)當細胞培養(yǎng)成致密單層后， 按0.02-0.002MOI分別接

6、種出血熱病毒I型和II型毒種(每個型別的同一工作種子批毒種應按同一MOI接種)， 置適宜的溫度下培養(yǎng)一定時間后， 棄去培養(yǎng)液， 用PBS沖洗去除牛血清， 加入適量的維持液， 置33-35繼續(xù)培養(yǎng)適當的時間。病毒收獲繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，收獲病毒液。根據細胞情況，可換以維持液繼續(xù)培養(yǎng)，進行多次收獲病毒液。同一細胞批的同一次病毒收獲液經檢定合格后可合并為單次病毒收獲液。236 單次病毒收獲液檢定按項進行。237 單次病毒收獲液保存于2-8°C保存不超過30天。2.3.8 病毒滅活病毒收獲液中按1：4000的比例加入-丙內酯（應在規(guī)定的蛋白質含量范圍內進行病毒滅活），置適宜溫度、在一定的時間

7、內滅活病毒， 并于適宜的溫度放置適宜的時間，以確保-丙內酯完全水解。病毒滅活到期后， 每個滅活容器應立即取樣，分別進行病毒滅活驗證試驗。2.3.9合并、超濾濃縮同一細胞批的多次單次病毒收獲液經檢定合格后可合并為單價病毒收獲液，并進行適宜的倍數的超濾濃縮至規(guī)定的蛋白質含量范圍。2.3.10 純化采用柱色譜法或其他適宜的方法進行純化。純化后取樣進行抗原量及蛋白含量測定，加入適宜的穩(wěn)定劑， 即為原液。1 單價原液保存于2-8條件下保存。2 單價原液檢定 按3.2項進行。2.4半成品配制將I型和II型出血熱病毒單價原液分別按抗原量為1：128稀釋后等量混合， 加入適宜濃度的穩(wěn)定劑及硫柳汞作為防腐劑，并

8、加入終濃度為0.50mg/ml氫氧化鋁佐劑吸附后即為半成品。半成品檢定按3.3項進行。2.5成品分批應符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。分裝應符合 “生物制品分裝凍干規(guī)程”規(guī)定。規(guī)格每瓶1.0ml。每1次人用劑量為1.0ml。包裝應符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1單次病毒收獲液檢定病毒滴定按.2項進行，病毒滴度應不低于6.5 lgCCID50/ml。無菌檢查依法檢查（附錄XII A），應符合規(guī)定。 支原體檢查依法檢查（附錄XII B），應符合規(guī)定。 抗原量測定采用酶聯免疫法測定，應不低于1：64。 病毒滅活驗證試驗按滅活后的單次病毒收獲液總量的0.1%抽取供試品，透析后接種Vero-E

9、6細胞，盲傳3代，每10-14天傳1代，每代以免疫熒光法檢查病毒抗原，結果應均為陰性。3.2單價原液檢定蛋白質含量應不高于160g/ml（附錄VI B 二法）?？乖坎捎妹嘎撁庖叻ǎ瑧坏陀?：512。無菌檢查依法檢查（附錄XII A），應符合規(guī)定。牛血清蛋白殘留量應不高于50ng/ml（附錄 VIII F）。 Vero細胞DNA殘留量應不高于100pg/ml（附錄IX B）。3.3半成品檢定 無菌檢查依法檢查（附錄XII A），應符合規(guī)定。3.4成品檢定鑒別試驗按.6項進行，應符合規(guī)定。效價測定不合格時，鑒別試驗不成立。外觀應為微乳白色混懸液體，含氫氧化鋁佐劑，久放形成可搖散的沉淀，不應有其

10、他異物。 裝量按附錄I A裝量項進行， 應不低于標示量。3.4.4化學檢定3.4.4.1 pH值應為7.28.0（附錄V A ）。3.4.4.2 硫柳汞含量應為不高于50µg/ml（附錄VII B）。3.4.4.3 氫氧化鋁含量應不高于0.6mg/ml（附錄VII F）。3.4.4.4抗生素殘留量檢查細胞制備過程中加入抗生素的應進行該項檢查， 采用ELISA法，應不高于10ng/ml。3.4.5效價測定按.6項進行，四只家兔的I型和II型出血熱中和抗體滴度均應不低于1：10。3.4.6熱穩(wěn)定性試驗疫苗出廠前應進行熱穩(wěn)定性試驗，于37放置7天，按3.4.5項進行效價測定，如合格，視為效價測定合格。3.4.7無菌檢查依法檢查（附錄XII A）