雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗(Vero細(xì)胞)

1、 雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（Vero細(xì)胞）Shuangjia Shenzonghezheng Chuxuere Miehuoyimao （Vero Xibao）Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome Bivalent Vaccine (Vero Cell), Inactivated本品系用型和型腎綜合征出血熱（簡(jiǎn)稱出血熱）病毒分別接種Vero細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲、病毒滅活、純化，加入氫氧化鋁吸附后制成。用于預(yù)防I型和II型腎綜合征出血熱。1 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符 “凡例”的有關(guān)要求。2 制造 2.1生產(chǎn)用細(xì)胞生產(chǎn)用細(xì)

2、胞為Vero細(xì)胞。細(xì)胞的管理及檢定應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)和檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。各種子批代次應(yīng)不超過(guò)批準(zhǔn)的限定代次。取自同批工作細(xì)胞庫(kù)的1支或多支細(xì)胞管，經(jīng)復(fù)蘇擴(kuò)增后的細(xì)胞僅用于一批疫苗的生產(chǎn)。細(xì)胞制備取工作細(xì)胞庫(kù)的1支或多支細(xì)胞管，經(jīng)復(fù)蘇擴(kuò)增至接種病毒的細(xì)胞為一批。將復(fù)蘇后的單層細(xì)胞消化，分散成均勻的細(xì)胞，加入培養(yǎng)液后混合均勻，置37培養(yǎng)3-4天，成均勻單層細(xì)胞。2.2毒種名稱及來(lái)源生產(chǎn)用毒種為分離自腎綜合征出血熱病人血清中的I型出血熱病毒SD9805株和II型出血熱病毒HB9908株， 或其他經(jīng)批準(zhǔn)的出血熱I型和II型毒株。病毒種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版中國(guó)藥典三部 通則中

3、“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。出血熱毒種SD9805株和HB9908株的原始種子批代次均為鼠腦第3代。原始種子批毒種經(jīng)Vero細(xì)胞傳代分別建立主種子批和工作種子批。I型出血熱毒種SD9805株主種子批應(yīng)不超過(guò)第9代，工作種子批應(yīng)不超過(guò)第14代；II型出血熱毒種HB9908株主種子批應(yīng)不超過(guò)第8代， 工作種子批應(yīng)不超過(guò)第13。種子批毒種的檢定主種子批應(yīng)進(jìn)行以下全面檢定，工作種子批應(yīng)至少進(jìn)行.1-4項(xiàng)檢定。.1鑒別試驗(yàn)將各型毒種10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度分別與已知的相應(yīng)型別的出血熱病毒血清參考品等量混合，同時(shí)以正常兔血清做空白對(duì)照。分別置37水浴90分鐘，接種Vero-E6單層細(xì)胞，于

4、37 CO2濃度為5%條件下培養(yǎng)10-14天，以免疫熒光法測(cè)定，中和指數(shù)應(yīng)大于1000。.2病毒滴定將各型毒種10倍系列稀釋，取適宜稀釋度接種Vero-E6細(xì)胞，于33培養(yǎng)10-12天，采用免疫熒光法進(jìn)行測(cè)定，病毒滴度均應(yīng)不低于7.0lgCCID50/ml。.3無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。.4支原體檢查依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符合規(guī)定。.5病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C），應(yīng)符合規(guī)定。.6免疫原性檢查取主種子批毒種制備雙價(jià)原疫苗，接種2kg左右的白色家兔（家兔血清出血熱病毒抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性），每批4只，后腿肌肉注射1.0ml，7天后以同法再免疫一次。第一次免

5、疫后4周采血分離血清，用空斑減少中和試驗(yàn)測(cè)中和抗體，中和用病毒為出血熱病毒76-118株和UR株，同時(shí)用血清參考品作對(duì)照（應(yīng)符合參考血清效價(jià)的標(biāo)示值），4只家兔的I型和II型出血熱中和抗體滴度均應(yīng)不低于1：10。2.2. 4毒種保存凍干毒種保存于-20以下，液體毒種應(yīng)置-60以下保存。2.3單價(jià)原液細(xì)胞制備按項(xiàng)進(jìn)行。培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為含10%滅能新生牛血清的MEM。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合現(xiàn)行版中國(guó)藥典三部的要求。人血白蛋白的質(zhì)量應(yīng)符合現(xiàn)行版中國(guó)藥典三部的要求。對(duì)照細(xì)胞病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C），應(yīng)符合規(guī)定。病毒接種、培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)成致密單層后， 按0.02-0.002MOI分別接

6、種出血熱病毒I型和II型毒種(每個(gè)型別的同一工作種子批毒種應(yīng)按同一MOI接種)， 置適宜的溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后， 棄去培養(yǎng)液， 用PBS沖洗去除牛血清， 加入適量的維持液， 置33-35繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。病毒收獲繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，收獲病毒液。根據(jù)細(xì)胞情況，可換以維持液繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行多次收獲病毒液。同一細(xì)胞批的同一次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單次病毒收獲液。236 單次病毒收獲液檢定按項(xiàng)進(jìn)行。237 單次病毒收獲液保存于2-8°C保存不超過(guò)30天。2.3.8 病毒滅活病毒收獲液中按1：4000的比例加入-丙內(nèi)酯（應(yīng)在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活），置適宜溫度、在一定的時(shí)間

7、內(nèi)滅活病毒， 并于適宜的溫度放置適宜的時(shí)間，以確保-丙內(nèi)酯完全水解。病毒滅活到期后， 每個(gè)滅活容器應(yīng)立即取樣，分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)。2.3.9合并、超濾濃縮同一細(xì)胞批的多次單次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單價(jià)病毒收獲液，并進(jìn)行適宜的倍數(shù)的超濾濃縮至規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍。2.3.10 純化采用柱色譜法或其他適宜的方法進(jìn)行純化。純化后取樣進(jìn)行抗原量及蛋白含量測(cè)定，加入適宜的穩(wěn)定劑， 即為原液。1 單價(jià)原液保存于2-8條件下保存。2 單價(jià)原液檢定 按3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.4半成品配制將I型和II型出血熱病毒單價(jià)原液分別按抗原量為1：128稀釋后等量混合， 加入適宜濃度的穩(wěn)定劑及硫柳汞作為防腐劑，并

8、加入終濃度為0.50mg/ml氫氧化鋁佐劑吸附后即為半成品。半成品檢定按3.3項(xiàng)進(jìn)行。2.5成品分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。分裝應(yīng)符合 “生物制品分裝凍干規(guī)程”規(guī)定。規(guī)格每瓶1.0ml。每1次人用劑量為1.0ml。包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1單次病毒收獲液檢定病毒滴定按.2項(xiàng)進(jìn)行，病毒滴度應(yīng)不低于6.5 lgCCID50/ml。無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。 支原體檢查依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符合規(guī)定。 抗原量測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，應(yīng)不低于1：64。 病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)按滅活后的單次病毒收獲液總量的0.1%抽取供試品，透析后接種Vero-E

9、6細(xì)胞，盲傳3代，每10-14天傳1代，每代以免疫熒光法檢查病毒抗原，結(jié)果應(yīng)均為陰性。3.2單價(jià)原液檢定蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于160g/ml（附錄VI B 二法）?？乖坎捎妹嘎?lián)免疫法，應(yīng)不低于1：512。無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。牛血清蛋白殘留量應(yīng)不高于50ng/ml（附錄 VIII F）。 Vero細(xì)胞DNA殘留量應(yīng)不高于100pg/ml（附錄IX B）。3.3半成品檢定 無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。3.4成品檢定鑒別試驗(yàn)按.6項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。效價(jià)測(cè)定不合格時(shí)，鑒別試驗(yàn)不成立。外觀應(yīng)為微乳白色混懸液體，含氫氧化鋁佐劑，久放形成可搖散的沉淀，不應(yīng)有其

10、他異物。 裝量按附錄I A裝量項(xiàng)進(jìn)行， 應(yīng)不低于標(biāo)示量。3.4.4化學(xué)檢定3.4.4.1 pH值應(yīng)為7.28.0（附錄V A ）。3.4.4.2 硫柳汞含量應(yīng)為不高于50µg/ml（附錄VII B）。3.4.4.3 氫氧化鋁含量應(yīng)不高于0.6mg/ml（附錄VII F）。3.4.4.4抗生素殘留量檢查細(xì)胞制備過(guò)程中加入抗生素的應(yīng)進(jìn)行該項(xiàng)檢查， 采用ELISA法，應(yīng)不高于10ng/ml。3.4.5效價(jià)測(cè)定按.6項(xiàng)進(jìn)行，四只家兔的I型和II型出血熱中和抗體滴度均應(yīng)不低于1：10。3.4.6熱穩(wěn)定性試驗(yàn)疫苗出廠前應(yīng)進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，于37放置7天，按3.4.5項(xiàng)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，如合格，視為效價(jià)測(cè)定合格。3.4.7無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A）