引物設計步驟與要點

1、弓丨物設計 step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象。2、用 Primer Premier5 搜索引物 打開Primer Premier5，點擊File-New-DNA sequenee, 出現(xiàn)輸入序列窗口， Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇 As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點擊Primer，進入引物窗口。 此窗口可以鏈接到 引物搜索”、引物編輯”以及 搜索結果”選項，點擊Search按鈕，進 入引物搜索框，選擇PCR primers ”，P

2、airs”，設定搜索區(qū)域和引物長度和產(chǎn)物長度。 在Search Parameters里面，可以設定相應參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認即可，但產(chǎn)物長度可以適當變化，因為100200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300500bp. 點擊OK,軟件即開始自動搜索引物，搜索完成后，會自動跳出結果窗口，搜索結果默認按照評分（Rati ng ）排序，點擊其中任一個搜索結果，可以在引物窗口 ”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，弓I物的各種信息等。 對于引物的序列，可以簡單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3 '不要出現(xiàn)連續(xù)的3個堿基相連的情況，比如 GGG或CCC

3、,否則容易引起錯配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應該在5570度之間，GC%應該在45%55%間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級結構信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級結 構，點擊該紅色按鈕，即可看到相應二級結構位置圖示。最理想的引物，應該都不存在這些二級結構，即這幾個按鈕都顯示為None”為好。但有時很難找到各個條件都滿足的引物，所以要求可以適當放寬，比如引物存在錯配的話，可以就具體情況考察該錯配的效率如何， 是否會明顯影響產(chǎn)物。對于引物具體詳細的評價需要借助于Oli

4、go來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5. 在Primer5窗口中，若覺得某一對引物合適，可以在搜索結果窗口中，點擊該引物，然后在菜單欄，選擇 File-Print-Current pair，使用PDF虛擬打印機，即可轉換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細信息。3、用Oligo驗證評估引物 在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇 Open，定位到目的eDNA序列（在primer中，該 序列已經(jīng)被保存為 Seq文件），會跳出來兩個窗口，分別為 Internal Stability （ Delta G ）窗 口和Tm窗口。在Tm窗口中，點擊最左下

5、角的按鈕，會出來引物定位對話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長度可以通過點擊Change Currentoligo length來改變。定位后，點擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點擊 Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強大的引物分析功能了。 Analyze中，第一項為 Key info，點擊Selected primers，會給出兩條引物的概括性信息， 其中包括引物的 Tm值，此值 Oligo是采用nearest neighbor method計算，會比 Primer5 中引物

6、的Tm值略高，此窗口中還給出引物的Delta G和3端的Delta G.3 '端的Delta G過高，會在錯配位點形成雙鏈結構并引起DNA聚合反應，因此此項絕對值應該小一些，最好不要超過9。 Analyze中第二項為Duplex Formation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引 物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇 Upper/Lower ，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應異常的重要因素，因此應該避免設計的引物存在二聚體，至少也要使設計的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其Delta G值應該偏低，一般不要使其超過4

7、.5kcal/mol ,結合堿基對不要超過3個。Oligo此項的分析窗口中分別給出了3'端和整個引物的二聚體圖示和Delta G值。 Analyze中第三項為Hairpin Formation ，即發(fā)夾結構分析?？梢赃x擇上游或者下游引物, 同樣，Delta G值不要超過4.5kcal/mol，堿基對不要超過 3個。Analyze中第四項為Composition and Tm ，會給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個堿基的組成比例和 Tm值。上下游引物的 GC%需要控制在 40%60%，而且上下游引物之間的 GC%不要相差太大。Tm值共有3個，分別采用三種方法計算出來，包括nearest

8、neighbormethod、 GC method 和 2(A + T) + 4(G + C)method，最后一種應該是 Primer5 所采用的 方法，Tm值可以控制在 5070度之間。第五項為False Priming Sites ,即錯誤引發(fā)位點， 在Primer5中雖然也有 False priming分析, 但不如oligo詳細，并且oligo會給我正確引發(fā)效率和錯誤引發(fā)效率，一般的原則要使誤引發(fā)效率在100以下，當然有時候正確位點的引發(fā)效率很高的話，比如達到400500 ,錯誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。 Analyze中，有參考價值的最后一項是PCR”在此窗口中

9、，是基于此對引物的PCR反應Summary，并且給出了此反應的最佳退火溫度，另外，提供了對于此對引物的簡短評價。若該引物有不利于 PCR反應的二級結構存在，并且Delta G值偏大的話，Oligo在最后的評價中會注明，若沒有注明此項，表明二級結構能值較小，基本可以接受。 引物評價完畢后，可以選擇File Print,打印為PDF文件保存，文件中將會包括所有 Oligo 軟件中已經(jīng)打開的窗口所包括的信息， 多達數(shù)頁。因此，打印前最好關掉 Tm窗口和Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二級結構分析窗口(若存在可疑的異常的話)和PCR窗口。4、引物確定后，對于上游和下游引物分別進行Blast

10、分析，一般來說，多少都會找到一些其他基因的同源序列，此時，可以對上游引物和下游引物的blast結果進行對比分析，只要沒有交叉的其他基因的同源序列就可以。、引物設計過程中的心得1、Primer 5.0搜索引物 Primer Length我常設置在18 30bp,短了特異性不好，長了沒有必要。當然有特殊要求 的除外，如加個酶切位點什么的。 PCR Product size最好是100 500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來， 條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 Search parameters 還是選 Manual 吧，Search stringency 應選

11、High , GC含量一般是 40 60 %。其它參數(shù)默認就可以了。 搜索出來的引物，按Rating排序，逐個送 Oligo軟件里評估。當然，搜索出的引物，其擴增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它，或是引物3端絲個A或T,或引物內(nèi)部連續(xù)的 G或C太多， 或引物3端淳個G或C,這樣的引物應作為次選，沒得選了就選它。對于這樣的引物，如 果其它各項指標還可以，我喜歡在引物末端去掉一個不滿意的或加上一個堿基，看看引物的評估參數(shù)有沒有變好點。2、Oligo 6.0評估引物 在analyze里，Duplex Formation 不管是上游引物、下游引物還是上下游引物之間，Themost stable 3 '

12、-Dimer 絕對值應小于 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall絕對值一般應小于多少kcal/mol跟PCR退火溫度有關，我?guī)状螌嶒灨杏X在 PCR退火溫度在65。的時候， The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol 沒有問題。 Hairpin Formation 根據(jù)黃金法則 False priming sites: Primer 的priming efficiency 應該是錯配地方的 4倍左右，更多當然 更好。 在PCR欄，丁香園戰(zhàn)友感覺其所顯示的optimal annealing temperatur

13、e數(shù)值值得參考。在PCR摸索條件的時候，退火溫度為其數(shù)值加減2的范圍就可以了。 Internal stability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3端不要過于穩(wěn)定。下圖引物3端過于穩(wěn)定，很容易導致不適當擴增。G參照黃金法則，這其實很好理解：把一滴水放到大海里，這滴水就會不停的擴散分布，擴散的越厲害 越穩(wěn)定，所以G絕對值越大結構越穩(wěn)定。3、其他兩個評價系統(tǒng)不一樣，丁香園戰(zhàn)友感覺oligo評價引物好點，primer出來的引物，一般按效率排序，再結合退火溫度和引物長度，選擇引物到oligo測試。這是初步的選擇，其實引物到了 oligo里，退火溫度也不一樣。3端的二聚體應該避免，這個要看退火溫度決定，一個50。的退火溫度肯定和65。對二聚體的影響不一樣了，一般來講盡量控制在4.5kcal/mol以下（丁香園戰(zhàn)友