人類染色體作圖

1、人類染色體作圖2022-3-62一、(一) 家系分析與基因定位 (三) DNA介導(dǎo)的基因定位（核酸探針方法） 2022-3-63 通過分析、統(tǒng)計(jì)家系中有關(guān)性狀的連鎖情況和重組率而進(jìn)行基因定位的方法。 five modes of Mendelian inheritance：Autosomal dominantAutosomal recessiveX-linked recessiveX-linked dominant-rareY-linked-very rare (hairy ears)2022-3-64uAffected fathers have all affected daughters a

2、nd no affected sons.uAffected females are more common than affected males.uThe trait is present in each generation or is lost.2022-3-65uCongenital Generalized Hypertrichosis is one medical syndrome that could have contributed to the werewolf myth.uScientists are interested in this atavistic syndrome

3、 as its understanding could shed light on how during our evolution we lost hair from parts of our body.2022-3-66uE B Wilson于1911年將紅綠色盲基因首次定位到X染色體上。 u1968年Donahue利用系譜分析將Duffy血型基因定位于1號染色體上，這也是人類首次將基因定位于常染色體上 。u1號染色體長臂在靠近著絲粒區(qū)的地方變長，這一異常是遺傳的，將其作為1號染色體上的一個(gè)特定的標(biāo)記，隨后發(fā)現(xiàn)這一標(biāo)記與Duffy血型具有平行性，表明這種染色體的異常結(jié)構(gòu)同這一基因相連鎖，因

4、此將此血型基因定位于1號染色體上。2022-3-67外祖父法：確定X染色體上基因間的相對距離。 根據(jù)雙重雜合體母親所生兒子中性狀的重組情況，可以估算重組率。 而母親X染色體上的基因組成，可以由外祖父的表型獲知。兩對連鎖基因時(shí)，雙重雜合體母親可能有兩種連鎖相：互引相：AG/ag-順式相 ( cis phase)互斥相：Ag/aG-反式相 (trans phase)例如：人類色盲（a）和蠶豆病基因（G6PD ）（g）2022-3-681. 若X染色體沒有重組交換無論母親順式還是反式，兒子的X染色體只有兩種。2022-3-692. 若母親X染色體的兩個(gè)基因間發(fā)生了重組交換2022-3-610r體細(xì)胞

5、遺傳學(xué)somatie cell genetics是以高等生物的體細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，采用細(xì)胞離體培養(yǎng)，細(xì)胞融合以及遺傳物質(zhì)在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移等方法，研究真核細(xì)胞內(nèi)基因的結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)規(guī)律和條件等的遺傳學(xué)分支學(xué)科?？梢岳@過減數(shù)分裂過程，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)方法，研究體細(xì)胞融合、突變、分離以及連鎖和交換等等。把基因定位在染色體上，作成細(xì)胞學(xué)圖。2022-3-611 1、體細(xì)胞雜交定位 體細(xì)胞雜交又稱體細(xì)胞融合，是指將兩種基因型不同的體細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過程，這種融合后的細(xì)胞又稱為雜種細(xì)胞，它兼有兩種細(xì)胞的染色體。2022-3-612經(jīng)紫外處理的仙臺(tái)病毒：具有附著點(diǎn)，能同時(shí)把兩個(gè)細(xì)胞融合在一起兩細(xì)胞靠近 細(xì)胞膜

6、融合，形成異核體 細(xì)胞核融合形成雜種細(xì)胞 繼續(xù)分裂 雜種細(xì)胞系 培養(yǎng)多代 其中一個(gè)物種的染色體隨機(jī)丟失，最后只剩一條或幾條1、人、鼠雜種細(xì)胞的獲得2022-3-613細(xì)胞融合 細(xì)胞核融合 染色體丟失繼續(xù)培養(yǎng)許多代，其中的一個(gè)物種的染色體逐漸隨機(jī)丟失，最后只剩一條或幾條。2022-3-614雜種細(xì)胞的篩選 (HAT選擇法)小鼠細(xì)胞株為胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）r人體細(xì)胞株是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT-）r這兩種酶相對應(yīng)的嘧啶和嘌呤核苷酸的代謝影響都不大，因此，兩種細(xì)胞都可以在完全培養(yǎng)基中生長.152022-3-6 HAT培養(yǎng)基： H為次黃嘌呤，是HGPRT的底物，為DN

7、A合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A為氨甲喋呤,是葉酸拮抗劑,可阻斷細(xì)胞利用正常途徑合成DNA. T為在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，為DNA合成提供原料162022-3-6因此在HAT培養(yǎng)基上: 人細(xì)胞：由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。 同時(shí)由于HGPRT的缺乏，無法利用次黃嘌呤通過旁路合成DNA（ 嘌呤合成障礙） 鼠細(xì)胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，由于無TK，無法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障礙 ） 雜種細(xì)胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鳥嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）172022-3-6182022-3-6192022-

8、3-62022-3-620 人類染色體的丟失是隨機(jī)的，所以各種雜種細(xì)胞系保留的人類染色體是不同的，從而可建立包括人類24條染色體在內(nèi)的一整套雜種細(xì)胞，其中每個(gè)雜種細(xì)胞都包含有一組人類染色體，這一套雜種細(xì)胞株系稱為克隆分布板(clone panel) 2022-3-6212、鑒別剩下的人類染色體 應(yīng)用熒光染色法和其他特殊的染色技術(shù)，可使染色體縱長上呈現(xiàn)各種不同的分帶（bands）。這些分帶的位置、寬狹和濃淡等隨染色體號碼的不同而不同。但就某一種分帶技術(shù)來說，每一染色體的分帶模式（banding pattern）是高度專一和穩(wěn)定的。因而可用于人類染色體識(shí)別，追循染色體丟失過程。 2022-3-62

9、22022-3-6233、基因定位u同線測定：根據(jù)某一基因產(chǎn)物與某條人體染色體的同時(shí)存在或同時(shí)消失的現(xiàn)象來判斷人類某一基因是否位于該染色體上。u區(qū)域定位：利用染色體結(jié)構(gòu)的變異，確定人類某個(gè)或某些基因在染色體的特定區(qū)域內(nèi)（如用染色體易位，缺失作圖）。2022-3-624同線法進(jìn)行人體基因的定位：人鼠雜種細(xì)胞株編碼GFEDCBA人類染色體號碼 核苷磷酸化酶+ 磷酸葡糖酸脫氫酶+ 蘋果酸氧化還原酶+ 羧肽酶C+ 異檸檬酸脫氫酶+ 葡萄糖磷酸變位酶1人類基因編碼的酶+5+4+3+2+ +12022-3-625 根據(jù)某一基因產(chǎn)物與某條人體染色體的同時(shí)存在或同時(shí)消失的現(xiàn)象來判斷人類某一基因是否位于該染色體

10、上，該方法叫同線測定。 2022-3-626 雜種細(xì)胞系人體基因與染色體ABCDE 基因或基因產(chǎn)物opqr+-+-+-+-+- 染色體序號123-+-+-+-+2022-3-627 利用染色體結(jié)構(gòu)的變異，確定人類某個(gè)或某些基因在染色體的利用染色體結(jié)構(gòu)的變異，確定人類某個(gè)或某些基因在染色體的特定區(qū)域內(nèi)（如用染色體易位，缺失作圖）。特定區(qū)域內(nèi)（如用染色體易位，缺失作圖）。r基因劑量效應(yīng)法基因劑量效應(yīng)法 ：利用某一特定染色體片斷缺失或重復(fù)后的病人或：利用某一特定染色體片斷缺失或重復(fù)后的病人或培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)所觀察到的基因劑量效應(yīng)進(jìn)行基因的區(qū)域定位。培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)所觀察到的基因劑量效應(yīng)進(jìn)行基因的區(qū)域定位。 例如

11、，發(fā)現(xiàn)先天愚型患者例如，發(fā)現(xiàn)先天愚型患者(21三體三體)的超氧化物歧化酶的超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因的活性為正常人的的基因的活性為正常人的1.5倍，于是將編碼倍，于是將編碼SOD-1的的基因定位在基因定位在21號染色體上。號染色體上。 4、區(qū)域定位2022-3-628r染色體缺失定位法: 在體外造成雜種細(xì)胞內(nèi)特定染色體的不同位置發(fā)生斷裂，形成各種類型的缺失末端，獲得一套特定染色體的缺失雜種細(xì)胞，然后通過檢測缺失雜種細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物存在與否對許多基因進(jìn)行區(qū)域定位。 2022-3-6292022-3-6301、克隆基因定位法（p91） 采用已克隆基因的cDNA探針與保留在雜種細(xì)胞內(nèi)的人染色體

12、DNA酶切序列進(jìn)行分子雜交，來確定克隆基因所在的染色體。2022-3-631以人體白蛋白基因cDNA為探針的克隆基因定位法 電泳條帶大小人細(xì)胞CHO中國倉鼠人CHO雜種細(xì)胞含4號染色體的雜種細(xì)胞不含4號染色體的雜種細(xì)胞陽性細(xì)胞陰性細(xì)胞3.5Kb6.8Kb因此，將此基因定位于4號染色體上2022-3-6322、原位雜交法 以標(biāo)記的探針（同位素、生物素或熒光染料）直接同中期染色體進(jìn)行原位雜交。2022-3-633 把來自人類珠蛋白基因的克隆DNA制備探針，與含有人體不同染色體組合的體細(xì)胞雜種雜交，發(fā)現(xiàn)只有攜帶人體第11號染色體的細(xì)胞株系才能與之雜交，于是就把這個(gè)基因定位于11號染色體上。2022-

13、3-634二、 通過遺傳重組所得到的基因在具體染色體上的線性排列圖稱為遺傳連鎖圖。 遺傳圖譜2022-3-635物理圖譜 這是一種高分辨率的染色體作圖，是確定遺傳標(biāo)志或界標(biāo)在染色體上所處的位置，以物理距離為圖距單位，如 bp，kp等。物理圖闡明了基因之間的精確距離。2022-3-636遺傳標(biāo)記： 指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。l在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異。l在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異。2022-3-637u 形態(tài)學(xué)標(biāo)記（morphological marker）u 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytological marker)u 生化標(biāo)記(bioch

14、emical marker)u DNA分子標(biāo)記(molecular marker)2022-3-638形態(tài)標(biāo)記即個(gè)體的外部形態(tài)特征。l簡單直觀、經(jīng)濟(jì)方便；l但其數(shù)量有限、多態(tài)性較差l表現(xiàn)易受環(huán)境影響，并且有一些標(biāo)記與不良性 狀連鎖。l形態(tài)標(biāo)記的獲得需要通過誘變、分離純合的過程，周期較長。l主要在早期使用。2022-3-639細(xì)胞學(xué)標(biāo)記即細(xì)胞染色體的變異。l包括染色體核型（染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）的變化。l與形態(tài)標(biāo)記相比，優(yōu)點(diǎn)是能進(jìn)行一些重要基因的染色體或染色體區(qū)域定位。l但細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料需要花費(fèi)較大的人力和較長時(shí)間來培育，難度很大；同時(shí)某些物種對染

15、色體變異反應(yīng)敏感；還有些變異難以用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢測。2022-3-640u生化標(biāo)記包括同工酶和等位酶標(biāo)記。分析方法是電泳和組織化學(xué)染色法,將酶的多種形式轉(zhuǎn)變成肉眼可辯的酶譜帶型。u優(yōu)點(diǎn)：一是表現(xiàn)近中性，對生物經(jīng)濟(jì)性狀一般沒有大的不良影響；二是直接反映了基因產(chǎn)物差異，受環(huán)境影響較小。u缺點(diǎn)：一是可用標(biāo)記數(shù)量少，二是染色方法和電泳技術(shù)有一定難度。2022-3-641 DNA分子標(biāo)記是指在DNA分子水平上，通過一定方式或特殊手段來反映生物個(gè)體之間或種群之間具有差異性狀的DNA片段。它直接反映基因組DNA間的差異。2022-3-642分子標(biāo)記的優(yōu)越性表現(xiàn)為：u直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組

16、織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；u數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測座位幾乎無限；u多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；u表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；u許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。2022-3-643u第一代分子標(biāo)記，以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如RFLP、VNTR）。u第二代分子標(biāo)記，以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如RAPD、AFLP、SSR）；u第三代分子標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記。它也是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。2022-3-644第一代分子標(biāo)記（基于Southern雜交技術(shù)的

17、分子標(biāo)記）1 RFLP標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism）由于各種原因引起DNA內(nèi)核苷酸排列順序改變，當(dāng)這種改變涉及到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，利用限制性內(nèi)切酶將DNA分子切割成許多長度不等的限制性片段，這些具有不同長度的限制性片段類型在人群中所呈現(xiàn)的多態(tài)分布現(xiàn)象就稱為限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs) 2022-3-6452022-3-646RFLP連鎖分析:通過家系連鎖分析,找出與突變基因相連鎖的DNA多態(tài)性,并將其作為遺傳標(biāo)記追蹤多態(tài)性在家族成員中的傳遞.2022-3-650PH23kbMspIMspIPH19kbMs

18、pIMspIMspI23/1923/1923/2319/1923kb19kb利用RFLP對苯丙酮尿癥進(jìn)行基因診斷苯丙酮尿癥:常染色體隱性遺傳病Dd2022-3-6512VNTR標(biāo)記數(shù)量可變串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeat),重復(fù)單位6-12個(gè)bp（小衛(wèi)星標(biāo)記） 在DNA的某些位置上這種串聯(lián)成簇的重復(fù)單位數(shù)目不同,因此，用在串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)的限制內(nèi)切酶酶切后，就會(huì)產(chǎn)生重復(fù)數(shù)目不等的片段。探針：位于此特殊VNTR附近獨(dú)有的DNA片段。探針：根據(jù)VNTR多態(tài)性本身設(shè)計(jì)，可檢測到所有相關(guān)的譜帶?？勺鳛镈NA指紋分析。2022-3-6522022-3-653

19、r 用內(nèi)切酶把總用內(nèi)切酶把總DNA切成不同長度的片段（切成不同長度的片段（VNTR上沒有酶切位點(diǎn)），再以上沒有酶切位點(diǎn)），再以VNTR中的特殊序列為中的特殊序列為探針進(jìn)行探針進(jìn)行Southern雜交，由于不同個(gè)體的這種雜交，由于不同個(gè)體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目及位置不同，所以串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目及位置不同，所以VNTR的的Southern雜交譜帶具有高度的個(gè)體特異性，故雜交譜帶具有高度的個(gè)體特異性，故又稱其為又稱其為DNA指紋（指紋（DNA fingerprints）。）。M1M3 M2M3 M1 M4 M1M3 M2M4 M2M4M2M12022-3-657第二代分子標(biāo)記1. RAPD標(biāo)記 隨機(jī)擴(kuò)增多

20、態(tài)DNA Randomly amplified polymorphic以單一的隨機(jī)引物(一般為10個(gè)堿基)，利用PCR技術(shù)，隨機(jī)擴(kuò)增未知序列的基因組DNA（非定點(diǎn)的擴(kuò)增基因組DNA）獲得的DNA片段長度變異。 2022-3-658RAPD標(biāo)記的特點(diǎn)有：（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳，不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便；（4）DNA樣品需要量少，成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 2022-3-6592. AFLP標(biāo)記擴(kuò)增酶切片段長度多態(tài)性amplified fragment length polymorphic基本原理：AFLP標(biāo)記是選擇性擴(kuò)

21、增基因組DNA酶切片段所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，其實(shí)質(zhì)也是顯示限制性內(nèi)切酶酶切片段的長度多態(tài)性，只不過這種多態(tài)性是以擴(kuò)增片段的長度不同被檢測出來。2022-3-661AFLP標(biāo)記的特點(diǎn)：由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以標(biāo)記數(shù)目是無限多的；可同時(shí)檢測多個(gè)座位，多態(tài)性極高；表現(xiàn)共顯性；分辯率高，結(jié)果可靠；1.目前該技術(shù)受專利保護(hù)，用于分析的試劑盒昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求較高。2022-3-6623STR標(biāo)記（簡單序列重復(fù)）短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat） STR標(biāo)記又叫微衛(wèi)星DNA標(biāo)記（SSR ），它是指基因組中存在的由2-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單

22、位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組中。 2022-3-663特點(diǎn)： 高度多態(tài)。 高頻率性、分布廣、平均分布。 STR兩側(cè)有特異性單拷貝順序。 相對容易進(jìn)行PCR微衛(wèi)星已成為取代RFLP的第二代分子標(biāo)記2022-3-6642022-3-665微衛(wèi)星DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）：500bp400bp300bp240bp 該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有4種。 微衛(wèi)星DNA差異最小只相差2個(gè)堿基（重復(fù)片段只有2個(gè)堿基）。2022-3-667第三代分子標(biāo)記：SNP(single nucleotide polymorphism)單核苷酸多態(tài)性SNP就是指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸，且其出現(xiàn)頻率大于1%。指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異,包括置換、顛換、缺失和插入.1996年美國E.S.Lander提出，稱為第三代DNA遺傳標(biāo)記2022-3-668AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCA