第六章石蠟切片技術(shù)

1、石蠟切片技術(shù)石蠟切片技術(shù) u切片技術(shù)的應(yīng)用到現(xiàn)在已有一百年多的歷史了。最早應(yīng)用的只是冰凍切片，隨著冰凍切片的應(yīng)用和實(shí)踐又進(jìn)一步利用石蠟的硬度，將要檢查的組織塊浸漬并包埋于這種堅(jiān)實(shí)的介質(zhì)之中，制成了石蠟切片石蠟切片。后來又利用明明膠膠，火棉膠火棉膠等物質(zhì)的韌性來包埋組織，制成了明膠切片明膠切片和火棉膠火棉膠切片。將各種組織制成非薄的切片標(biāo)本，需要經(jīng)過一系列比將各種組織制成非薄的切片標(biāo)本，需要經(jīng)過一系列比較繁雜的過程，較繁雜的過程，制作切片的主要過程有：制作切片的主要過程有：u（1）取材u（2）固定u（3）脫水u（4）包埋u（5）切片u（6）染色u（7）封固在這七個(gè)主要過程中，又包括著若干步驟。u

2、 冰凍切片 石蠟切片 火棉膠切片u u 取 材u u 固 定 u u冰 凍 沖 水u u 脫 水u u 透 明 乙醚酒精u u 浸 蠟 膠液滲透 u u 石蠟包埋 火棉膠包埋 u u冰凍切片 切 片 切 片 u u染 色 染 色 染 色 u u封 固 封 固 封 固 第一章第一章 組織標(biāo)本的處理組織標(biāo)本的處理第一節(jié)第一節(jié) 取取 材材u取材是制作切片程序中的首要步驟，取材不當(dāng)，將直接影響病理診斷和科研工作的效果。組織標(biāo)本的選用非常重要，不能隨意的切取組織來制作組織切片，否則病理檢驗(yàn)的結(jié)果是不會(huì)令人滿意的。 一、取材工具：一、取材工具： 取材刀具必須鋒利。切取標(biāo)本不應(yīng)該擠壓和揉擦，不應(yīng)使用有鉤鑷子

3、或血管鉗等手術(shù)器械鑷取標(biāo)本，以免損害組織造成人為組織變化，給診斷帶來困難或?qū)е洛e(cuò)診，漏診。 二、取材的注意事項(xiàng)：二、取材的注意事項(xiàng)：（一）大體標(biāo)本（一）大體標(biāo)本u應(yīng)選擇病變或可疑病變的組織。必要時(shí)選取病變與正常組織交界處。切取標(biāo)本的原則是求準(zhǔn)而不是求量多，所以切取組織宜小不宜大，以不超過20 x15mmx3mm20 x15mmx3mm為度，過大過厚會(huì)影響對(duì)標(biāo)本的固定，另方面也影響切片的制作。特殊目的者應(yīng)屬例外。 u1. 了使組織切片的結(jié)構(gòu)清楚，取材要及時(shí)，組織塊必須爭取時(shí)間及時(shí)固定，組織的固定以愈新鮮愈好。u2. 取材時(shí)對(duì)大體標(biāo)本（肉眼標(biāo)本）繪制圖象，進(jìn)行仔細(xì)描述。包括形狀、大小，硬度，顏色，

4、病灶（或可疑病變）部位等。對(duì)所取的組織應(yīng)定位編號(hào)。u3. 切取各組織塊時(shí)，切勿擠壓損傷，對(duì)典型或具有教學(xué)和科研價(jià)值的肉眼標(biāo)本，不能因取材而對(duì)標(biāo)本造成人為的“病變”。u4. 取下的組織塊應(yīng)盡量防止其彎曲扭轉(zhuǎn)，如胃腸等組織，應(yīng)先平展于草紙上粘著以后，慢慢地放入固定液中.固定液的量要充足，應(yīng)為固定組織的1010倍。u5. 組織采取應(yīng)在正常與病灶交界之處。組織形狀最好為方形或長方形狀，這樣有利于制片。組織厚薄要均勻。u6. 各組織塊應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)，如腎臟組織包括皮質(zhì)部分和髓質(zhì)部分。在有漿膜的臟器（如胃等）組織塊中，要至少有一塊帶有漿膜。u7. 組織內(nèi)的鈣化病灶或骨質(zhì)，應(yīng)在充分固定之后進(jìn)行脫鈣。

5、 u組織里存有鈣鹽可妨礙用常規(guī)方法制作良好切片。骨組織及鈣化病灶，經(jīng)過固定后，必先將鈣鹽除去使組織軟化，才能進(jìn)行常規(guī)切片。如脫鈣不全則切片易撕開或碎裂并損傷切片刀刃。脫去鈣鹽的過程稱為脫鈣。 u骨組織固定24小時(shí)后，鋸下不超過0.5mm厚的薄骨片，再以10%福爾馬林固定后進(jìn)行脫鈣。（未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織約大三倍）。骨組織過厚則需延長脫鈣時(shí)間，長時(shí)間浸于強(qiáng)酸影響切片染色效果。u在不影響診斷的條件下，應(yīng)將骨組織周圍的軟組織全部剝?nèi)?。如果切片目的在于觀察骨髓病變或骨組織腫瘤，最好除去一部分正常的致密的骨組織，以利于脫鈣和制片。u脫鈣前最好先將骨組織進(jìn)行脫脂。u脫鈣要徹底

6、，脫水應(yīng)充分，在脫水過程中，要注意不使其過度硬化。硝酸脫鈣液硝酸脫鈣液配方：福爾馬林 5ml 硝酸（比重1.41） 7.515ml 蒸餾水 加至100mlu脫鈣步驟脫鈣步驟取材：骨組織固定于10%福爾馬林24小時(shí)后再鋸取厚度約0.5厘米骨片。固定：再以10%福爾馬林固定2天。將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。流水沖洗24小時(shí)（除酸）。進(jìn)行常規(guī)脫水，透明，浸蠟，切片。u8. 標(biāo)本上（組織塊）附著的軟組織如脂肪等，如屬非病變成分，則應(yīng)在不影響病理診斷的原則下，盡量剝?nèi)セ蚯谐?，以利制片。u9. 組織塊的固定時(shí)間不宜過長或過短，不同的固定液，固定時(shí)間有所不同，固定后的組織需要用流水

7、沖洗，再進(jìn)行脫水制片。u10. 切取鏡檢組織塊后，可將剩余的組織放入70%灑精中保存，這樣有利于日后再取材切片時(shí)的細(xì)胞染色。u11. 組織應(yīng)平整u12. 多取包膜u13. 充分暴露病灶，取材應(yīng)避免過多的壞死組織或凝血塊，如有手術(shù)線結(jié)等雜物應(yīng)拔除。（二）小標(biāo)本（二）小標(biāo)本u1. 微量標(biāo)本和易碎標(biāo)本，為避免破損或丟失應(yīng)以紗布包裹，但包裹前紗布必須浸濕，以免標(biāo)本粘附紗布上。u2. 小標(biāo)本盡量描述標(biāo)本的數(shù)量u3. 小標(biāo)本盡量取盡u4. 多量的小標(biāo)本應(yīng)盡量完全取材，未取完的，余下的可備用。u5. 粘膜和皮膚組織應(yīng)于“立埋”u6. 嚴(yán)防擠壓組織。u7. 內(nèi)窺鏡鉗取或穿刺取得的小標(biāo)本，由于體積小，不易識(shí)別，

8、可用伊紅等染料染上顏色后包于綢布或吸水紙、擦鏡紙中，以免包埋過程中丟失。 u三、切取的組織塊的編號(hào)、數(shù)量和取材后是否有存留均應(yīng)記錄u四、補(bǔ)取情況應(yīng)記錄。第二節(jié)第二節(jié) 組織的固定組織的固定一、固定的意義一、固定的意義u概念：概念：固定是指將各種組織浸入防腐劑內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為不溶性。固定的作用即是用一種方法將組織盡可能保持在它原來的形態(tài)，且能適于某些研究程序u凡是需要制作作病理檢驗(yàn)標(biāo)本的各種組織，無論是制作切片標(biāo)本，還是制作巨體標(biāo)本，首先必須固定。在制作切片過程中，固定最為重要的步驟，一張優(yōu)秀的組織學(xué)切片是建立在適當(dāng)而完全的固定基礎(chǔ)之上的。固定不良在以后制片的任何階段皆不能補(bǔ)救。因此制片的優(yōu)劣

9、首先取決于最初固定適當(dāng)與否。u重要的是，被固定組織在動(dòng)物死后或從活體切取后要盡可能立即固定。及時(shí)的取材給迅速固定提供了先決條件。如果不迅速固定，造成固定不良，將導(dǎo)致染色不良后果。組織的良好固定，應(yīng)該是一次性的；某些固定劑還具有助染的作用，可使細(xì)胞各部易于著色。固定不良的組織，即使進(jìn)行補(bǔ)充固定也起不到改善染色的效果。二、固定的目的和效果二、固定的目的和效果u固定組織的目的是設(shè)法得到接近正常生命狀態(tài)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有人說“形態(tài)學(xué)的美是良好固定產(chǎn)物”，這說明固定的特殊重要作用。u1 1、抑制自溶和腐?。骸⒁种谱匀芎透瘮。?組織的固定能保持細(xì)胞與生活時(shí)的形態(tài)相似。因?yàn)楫?dāng)機(jī)體生命活動(dòng)停止、或局部器官、組織割

10、離機(jī)體之后，組織細(xì)胞的代謝功能即行喪失，新鮮組織如果不經(jīng)固定，任意放置，由于細(xì)胞內(nèi)酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解，以及細(xì)胞的孳生等各種因素的作用，則易因細(xì)菌繁殖而致組織腐爛。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分解酶將蛋白質(zhì)分解為氨基酸后脫離細(xì)胞而引起組織的自溶。 u2 2、保存：、保存： 細(xì)胞經(jīng)過固定，不但可以防止自溶和細(xì)菌性腐敗，而且能沉淀或凝固組織內(nèi)的各種成份和病理代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)，脂及脂蛋白、脂肪、糖類、色素，其它碳水化合物，無機(jī)成份，微生物等都可以經(jīng)過固定而保存下來，并在制片過程中不為其他試劑溶解破壞。u3 3、硬化：、硬化：固定劑的硬化作用能使柔軟組織（如腦）的質(zhì)地變硬而易于操作。u4 4、膠質(zhì)物體的固化：、膠質(zhì)物

11、體的固化：固定能使細(xì)胞正常的半液體狀（溶膠）變?yōu)椴荒苣孓D(zhuǎn)的固體狀（凝膠）粘度。u5 5、肉眼鑒別：、肉眼鑒別：固定可將各種細(xì)胞和組織成分的析光率作不同程度的改變，增強(qiáng)組織的析光指數(shù)，這樣能使各種染色成份較之未固定時(shí)更容易辨認(rèn)。u6 6、對(duì)染色的影響：、對(duì)染色的影響：某些固定劑尚具有一定的媒染作用而增進(jìn)染色（如苦味酸對(duì)于染色的媒染作用）可使細(xì)胞各種部位易于著色，所以組織固定后有利于制片染色和在顯微鏡下的觀察。此外，固定劑有時(shí)也會(huì)影響染色效果，導(dǎo)致著色效果不理想（如福爾馬林對(duì)水溶猩紅染色的影響）。u7 7、滲透和固定：、滲透和固定：固定還可以使組織和細(xì)胞的各種滲透壓不再發(fā)生改變，在制片時(shí)就能在最大

12、范圍內(nèi)保持組織和細(xì)胞的原來形態(tài)。三、固定的方法及注意事項(xiàng)：三、固定的方法及注意事項(xiàng)：為使組織固定充分，應(yīng)做到固定容器要合適、固定時(shí)間為使組織固定充分，應(yīng)做到固定容器要合適、固定時(shí)間要充足，固定液量要足夠。要充足，固定液量要足夠。u合適容器合適容器 固定組織時(shí)，應(yīng)選擇合適的容器、一般容器的容積是組織的10-15倍以上。標(biāo)本瓶應(yīng)選擇瓶口較大的為宜，這樣便于固定后的標(biāo)本經(jīng)小口瓶硬塞進(jìn)去，這樣不僅不利于標(biāo)本易于取出，還可能造成人為擠壓組織而致形態(tài)變化，對(duì)大件的標(biāo)本應(yīng)按巨檢常規(guī)切片后放于容器固定。u充足時(shí)間充足時(shí)間 組織固定的時(shí)間要足夠，根據(jù)標(biāo)本體積大小不同，固定時(shí)間應(yīng)有所不同，組織越大越厚，固定時(shí)間應(yīng)

13、越長，反之。一般4-12小時(shí)或更長。在溫箱內(nèi)將固定液稍加溫，可使固定作用加快而縮短固定時(shí)間。u足量的固定液足量的固定液 固定組織時(shí)，應(yīng)該使用足量的固定液，多比少好，一般應(yīng)為組織體積的5-10倍，最少也不應(yīng)于五倍。標(biāo)本最好懸浮于固定液之中。如標(biāo)本塊多時(shí)，固定時(shí)不應(yīng)重疊。不要先將標(biāo)本塊放入容器后再注入固定液，以免標(biāo)本貼付于器皿。u標(biāo)本如不能及時(shí)制片，應(yīng)改換適當(dāng)?shù)谋４嬉?。u在配制混合液時(shí)，氧化劑不能與還原劑混合，以免引起化學(xué)反應(yīng)，失去固定作用。u對(duì)于某些需要制作神經(jīng)染色和酶反應(yīng)等組織的固定，要求較一般嚴(yán)格，組織的大小，固定的時(shí)間，溫度的適當(dāng)都應(yīng)慎重考慮，尤其是對(duì)于酶反應(yīng)的固定液，一般都要置于冰箱，在

14、低溫的條件下進(jìn)行固定。固定不好，是得不到滿意的切片和合乎標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)效果的。u任何固定液對(duì)人體都有損害作用，因此固定液的容器必須密閉，以防揮發(fā)損傷器官和眼睛，忌用手與固定劑直接接觸，以免損傷皮膚。四、固定劑的選擇四、固定劑的選擇理想的固定劑應(yīng)該具備下列幾種性能：u1、滲透性強(qiáng)：固定劑必須能迅速滲入組織，這樣組織內(nèi)各種成分才能盡快地被固定在原位置，而不致彌散。u2、組織在固定液的作用下，不應(yīng)發(fā)生顯著的收縮和膨脹現(xiàn)象u3、固定劑應(yīng)該有利組織切片和染色，這其中含有兩種意義； （1）固定劑對(duì)固定后的組織應(yīng)有利于染色劑的染色。例如：重鉻酸鉀對(duì)于類脂質(zhì)具有一定媒染作用 （2）固定劑能將組織或細(xì)胞中某些必須觀

15、察的成分予充分固定而保存下來，以便染色。例如：酸可以滲入脂類物質(zhì)使其固定下來而不至在制片過程中為酒精和二甲苯溶解或較少地溶解 4、固定液應(yīng)該同時(shí)也是一種較好的保存液。對(duì)標(biāo)本的固定應(yīng)根據(jù)組織的制片目的和要求去選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?duì)標(biāo)本的固定應(yīng)根據(jù)組織的制片目的和要求去選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┪濉⒐潭▌┑姆N類五、固定劑的種類 組織制片技術(shù)上所使用的固定劑種類繁多，性能各有不同，有的為氧化劑，有的為還原劑；有的呈酸性，有的呈堿性；有的滲透力強(qiáng)，有的滲透力弱；有些易使組織收縮，有些則使組織發(fā)生輕微膨脹現(xiàn)象。一般地說，單一固定劑要想使組織固定后達(dá)到某種特殊染色要求是比較困難的。因此，在標(biāo)本固定中常使用兩種以上成分（

16、固定劑）的混合固定液。單一固定劑 甲醛甲醛 (HCHO) 甲醛是一種氣體，約有40%重量溶于水。這是一種還原劑，頗易揮發(fā)，這種飽和溶液稱為甲醛溶液；其商品名叫福爾馬林。u10%福爾馬林的組成系 甲醛溶液（福爾馬林） 10ml 水 90mlu甲醛是一種使用廣泛、簡便的固定劑，同時(shí)又是一種良好別的標(biāo)本保存液。經(jīng)它固定的標(biāo)本，可適應(yīng)一些特殊染色。它的滲透性較強(qiáng)，固定均勻，能增加組織的韌性，組織收縮輕微，硬性大于酒精。u福爾馬林主要是由甲醛的聚合形式構(gòu)成，然而聚合形式的固定效果低于單體形式構(gòu)成的10%福爾馬林，為阻止在放置一定時(shí)間的重聚作用，一般將溶液的PH值調(diào)節(jié)至中性或偏堿性。u甲醛與蛋白質(zhì)是在分子

17、間的交聯(lián)上起反應(yīng)，最終產(chǎn)生一種不溶性產(chǎn)物。它經(jīng)過絡(luò)合交聯(lián)，使蛋白質(zhì)固定，能較好地保存脂類；對(duì)肝糖也有固定作用，但必須及時(shí)固定及時(shí)處理，以免產(chǎn)生水解。酒精（C2H5OH）u酒精為常用的有機(jī)溶劑，高濃度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白，對(duì)肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖經(jīng)酒精固定成水溶性狀態(tài)，因此，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本如果固定后用水洗滌，則核著色欠佳，肝糖也將被水解。作為一種脂溶劑，濃度在50%以上的酒精可溶解脂肪和類酯體，因此，對(duì)脂類的證明，高爾基氏體，線粒體等染色不宜使用酒精作固定劑。u酒精還可溶解血紅蛋白和損害多數(shù)其他色素，因此，如果證明組織蛋白的色素時(shí)也不宜以酒精作為固定劑u濃酒精有較大的收縮力，

18、被它固定的組織收縮顯著，表面發(fā)硬，因而酒精較難滲入到組織中去，組織必須用酒精固定時(shí)宜先用80%的酒精固定數(shù)小時(shí)，然后再換95%酒精，這樣可以避免組織過度收縮，因此它的穿透力緩慢且與組織長期接觸能使之硬化，如需要證明尿酸結(jié)晶和保存糖類，則須用100%酒精固定。u酒精既有固定作用，又有脫水作用，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本不需洗滌，可用較高濃度酒精直接進(jìn)行脫水，也可暫存于70%酒精中。 (3)(3)乙酸乙酸( (醋酸、冰醋酸醋酸、冰醋酸) ) 是具有刺激氣味的無色液體，可與水、乙醇以各種比例混溶，用于固定的濃度為0.35。醋酸穿透力強(qiáng)，染色質(zhì)固定快，一般大小的組織只需固定3060 mi即可，但可使組織膨脹，一

19、般不單獨(dú)使用，常與乙醇配制成混合固定液，以抵消乙醇所致的組織收縮和硬化。醋酸可抑制細(xì)菌和酶的活性，防止自溶。對(duì)糖、脂肪、類脂無固定(保存)作用，但可使核蛋白沉淀，細(xì)胞核顯示清晰，是染色體最佳固定液。用醋酸固定的組織不必水洗，可直接移人50或70乙醇中。 混合固定劑(1)中性甲醛液中性甲醛液 具有滲透力強(qiáng)、組織收縮小、染色效果好的特點(diǎn)?？捎米鞒Ｒ?guī)固定液或標(biāo)本保存液，脂肪染色常用此液固定。中性甲醛液還能保存大多數(shù)抗原物質(zhì)，提高免疫組化檢測的陽性率，因此，是免疫組化最常用的固定液。固定時(shí)間一般為624h。此液中甲醛的濃度為68u配方：u40甲醛 150200 mLu磷酸二氫鈉 4 gu磷酸氫二鈉 13 gu蒸餾水 800850 mIu(2)乙醇乙醇-醋酸醋酸-甲醛液甲醛液(AAF液液) AAF液由對(duì)組織滲透速度快的乙醇(alcohol，A)、醋酸(acetic acid，A)和甲醛(formalin，F(xiàn))三種固定液混合而成，其特點(diǎn)是固定快速，對(duì)脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有很好的固定作用，避免了三種固定液單獨(dú)使用引起的組織收縮或膨脹，是一種優(yōu)良的混合固定液。AAF液兼有固定和脫水的作用，經(jīng)過AAF液固定后的組織塊可直接移入95乙醇進(jìn)行脫水。u 配方： 95或無水乙醇 85 mL 醋酸 5 mL 40甲醛 10