專業(yè)英語論文翻譯

1、MET基因復制數(shù)量的增加賦予單克隆抵抗體抗MET的能力并且建立藥物依賴性關鍵詞：MET ，MV-NV30單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，抗性，藥物依賴性【摘要】：被MEI原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體領導了具體抑制劑的發(fā)展并在癌癥中起很重要的作用，其中現(xiàn)在一些正處于前進的臨床試驗階段就以前的經(jīng)驗表明對大多數(shù)靶向治療最主要的限制是抗性的出現(xiàn)。在對MET單克隆抗體抗性和抗體對化學抑制劑旁路抗性（反之亦然）一無所知時，酪氨酸激酶抑制劑對MET的抗性機制就已經(jīng)被提出。EBC1型肺癌細胞是MET基因擴增的結(jié)果，并且這種細胞對MET抑制劑非常敏感，包括MET單克隆抗體的單機形式在內(nèi)。我們培養(yǎng)生成抵抗抗體的細胞

2、發(fā)現(xiàn)這種抗性是由于MET基因大量復制擴增和它的受體顯著表達而來。這種過度表達可以使單克隆抗體的“脫落”活動達到飽和，并且能夠防止表面的MET受體的有效的下調(diào)和抑制劑的活化作用。值得注意的是MV-DN30抗體的抗性細胞是MET耐受細胞對MET酪氨酸激酶抑制劑也很敏感。除此之外，抗體抗性細胞還具有藥物依賴性,MV-DN30的去處導致它們死亡是由于它們的過度信號表達。在實驗中，對MET酪氨酸激酶抑制劑存在抗性的細胞仍然對MV-DN30抗體的作用敏感。結(jié)果表明一種不連續(xù)的通過抗體和化學激酶抑制劑聯(lián)合治療可能會使靶向治療的臨床反應和對MET抗體治療旁路的抗性增加?？s略語：MV-DN30-單價DN30，T

3、KEs酪氨酸激酶抑制劑，HGF肝細胞生長因子，MAPK有絲分裂原活化蛋白激酶1.簡介可以抑制一個特定的目標分子化合物的靶向治療法開辟了治療癌癥的新道路。與主要殺死擴散細胞為主的傳統(tǒng)化療不同的是靶向藥物對腫瘤細胞采取一種更具體的治療方式。靶向治療依賴于“癌基因沉癮”的概念。這就意味著單個基因的抑制或死亡是由于它們的沉癮，或者至少抑制它們的生長（溫斯坦,2002）。臨床試驗中的特定抑制劑的發(fā)展給腫瘤細胞的“Achilles heel”的識別提供支持（溫斯坦和喬，2006）。盡管靶向治療在一部分癌癥患者中取得了較優(yōu)異的效果，還有重要的一點就是部分癌癥病人對藥物的選擇表達沒有起到治療作用（原發(fā)性），除

4、此之外，幾乎總是一開始患者反應變成后來對治療的抵抗和復發(fā)（繼發(fā)性）。因此，最關鍵的就是要發(fā)現(xiàn)對治療抵抗的機制并且找到繞過它們的方法。癌基因和人類癌癥密切相關，酪氨酸激酶起著決定性作用。這個觀察發(fā)現(xiàn)許多腫瘤沉溺其中使得蛋白激酶成為了治療癌癥的理想目標（巴塞爾加，2006; Gschwind等人，2004）。在臨床診斷中主要使用一種較小的激酶抑制劑和單克隆抗體來抑制酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制劑是一種可以抑制靶蛋白酶活性的小分子物質(zhì)。它們能有效地瞄準膜結(jié)合位點和細胞內(nèi)的激酶并且很容易在體內(nèi)擴散。單克隆抗體已被廣泛用于臨床并取得了可觀的成果。這些分子的優(yōu)點在于它們具有很高的特異性。在癌癥治療中的可以抗

5、癌的RTKs單克隆抗體已經(jīng)被批準在乳腺癌和結(jié)腸癌中使用(分別針對HER2和表皮生長因子受體) 并可作為抗血管增生的藥物（針對血管內(nèi)皮生長因子受體）。除此之外，很多針對于其他目標的單克隆抗體正處與發(fā)展和試驗階段。最近，一種作為癌癥治療目標的RTK受到關注，這種RTK是由致癌基因編碼的在肝細胞生長因子上的酪氨酸激酶受體。在和肝細胞生長因子結(jié)合后，MET活化并啟動一個復雜的生化程序，這個過程被稱作“浸潤性上長”。在腫瘤組織中，浸潤性生長的增進可以迫使腫瘤細胞從腫瘤組織中分解下來侵蝕基底膜，滲入基質(zhì)中，甚至定居于新的組織中來實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。很多研究結(jié)果表明MET在人類的許多腫瘤中具有活性，并且它與對直接激酶

6、療法的持續(xù)抗性密切相關。除此之外，還表明細胞顯示大量復制（超過8張）和隨之而來的過度表達和獨立配體的激活都是沉溺于這種致癌基因和抗MET藥物的應答中。在前期設置得到的基本結(jié)果，幾種特定的多目標的酪氨酸激酶抑制劑和直接針對于MET或者HGF的抗體已經(jīng)進入了臨床試驗階段。在活體和動物模型進行的研究已經(jīng)表明用TKIs長期治療會導致機體的治療耐受性。對MET TKIs的抗性可能是由于一些機制，比如MET基因擴增，過度表達，MET點突變，MET平行路徑的激活和KRAS基因的擴增機制。然而，關于對MET的單克隆抗體的再次具有抗性一無所知。我們以前報道過主要針對細胞外的部分MET的抑制性單克隆抗體的研究進展

7、。它的誘導、再結(jié)合、達到MET脫落閾值的能力使其有抑制活性，剩余的跨膜片段通過蛋白酶體降解途徑處理掉。因此，DN-30結(jié)合到MET后的結(jié)果是使其變成可溶性的誘餌MET并且蛋白水解酶會講解MET激酶。 這促進了MET介導的生物活性的抑制作用。設計了這樣一個過程就是因為DN-30的結(jié)合使得MET激酶部分活化并且導致抗體介導的受體同源二聚體化和單價Fab片段失去競爭活性的一個過程。在這個研究中我們表明了不斷用MV-DN30來治療沉癮癌細胞會使其具有抗性的原因是MET基因的大量復制和MET的過度表達超過了MV-DN30對其有效下調(diào)并使其失去活性的的能力。值得注意的是，MV-DN30抗性細胞還會一直對M

8、ET TKIs產(chǎn)生耐受性和敏感性。有趣的是，它們獲得了藥物耐受性，當受到MV-DN30的驅(qū)除致死它們的是過多的信號表達。我們還表明對MET TKIs 有抗性的細胞也對MV-DN30敏感，所以，MV-DN30和MET TKIs 對腫瘤細胞的作用是相互促進的。2.材料與方法 2.1.細胞和試劑EBC1 細胞從一個患有轉(zhuǎn)移皮膚腫瘤的病人取得，這個患者還患有肺鱗狀細胞癌，病例是從日本癌癥資料庫購買得到。 GTL16 是一種實驗室里的克隆胃癌細胞系。HEK-293T細胞系分離于人類胚胎時期的腎，A549細胞系來源于肺癌，都是從ATCC購買來培養(yǎng)的。對MV-DN30有抗性的EBC1細胞可以通過一個逐步的方

9、法培養(yǎng)得到，由Sigma Tau R&D 提供的通過暴露親代細胞方法來增加抗MET單價單克隆抗體的濃度。親代細胞用10 mg/ml 的MV-DN30治療約一個月，直到生成的R10細胞開始產(chǎn)生抗性為止，R10抗性細胞又用逐步增加濃度的MV-DN30治療。所有的抗體耐受細胞培養(yǎng)在存在MV-DN30并且可以使它們產(chǎn)生耐受性的條件下。大約兩個月可以分離到R20抗體抗性細胞，四個月可以分離到R80抗體耐受細胞。EBC1 and GTL16 細胞對MET TKIs PHA-665752 (EBC1 RPHA 50 nM and GTL16 RPHA 150 nM) 都有耐受性，并且向描述的那樣培養(yǎng)

10、可以一直保持PHA-665752的存在。該細胞系的遺傳身份通過一個短的串珠狀重復序列（STR）識別，這段序列在2013年7月再次重復出現(xiàn)。We 我們利用下面的小分子：ATP競爭行MET TKIs PHA-665752 (Tocris Bioscience) and JNJ-38877605 (John-son & Johnson) 和p38MAP激酶抑制劑SB203580 (Merck). 2.2. mRNA和基因組DNA的分析 用Trizol 試劑提取得到的RNA被檢測到利用多文士病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物合成，cDNA可以用實時的利用電源帶動的綠色PCR混合的PCR 技術(shù)來實現(xiàn)擴增，

11、根據(jù)制造商的說明下面的MET和ACTIN特異性引物要用到： hMET ex 19 Fw: 50-AGTTTACCACCAAGTCAGATGTGT-30; hMET ex 20 Rw: 50-GGGCTCCTCTTGTCATCAGC-3; hACTIN Fw: 50-GGAGGAGCTGGAAGCAGCC-30; hACTIN Rw: 50-GCTGTGCTACGTCGCCCTG-30.根據(jù)制造商的說明用實時PCR技術(shù)來分析用純化的DNA基因組迷你試劑盒分析從細胞中提取到的基因組DNA，這種技術(shù)是用 TaqMan基因表達的主要結(jié)構(gòu)和TaqMan探針MET基因和RNaseP控制基因的實時定量PCR

12、分析。MET的mRNA的成倍增加和EBC1中MET基因的大量復制以及MV-DN30抗性細胞歸一化然后被認可。2.3. 蛋白印跡分析和脈沖追蹤代謝標記蛋白提取液 (40 mg), 細胞上清液(20 ml) 。在細胞裂解前2小時把MET TKI JNJ-38877605加入到指定的地方。 免疫印跡法使用了以下的初級抗體：the anti-MET Intracellular domain (ICD) (zymed, #370100) from Invitrogen, anti-MET ECD (DL21) obtained as described (Prat et al., 1991), anti

13、-phospho-Tyr1234-Tyr 1235MET (#3126), anti-AKT (#9272), anti-phospho-Ser473AKT(#4060),anti-p44/42MAPK(#9102),anti-phospho-Thr202-Tyr204p44/42MAPK#9101),anti-p38MAPK(#8690),anti-phospho-Thr180-Tyr182-p38 MAPK (#9215), from CellSignaling;anti-vinculin (#V9131) from Sigma and anti-b-actin (#I-19 sc-161

14、6) from Santa Cruz Biotechnology. Secondary IgG HRP-Peroxidase antibodies were from Amersham.脈沖追蹤實驗的1106WT，或MV-DN30抗性的EBC1細胞(R80)都被平鋪在60mm的盤里。R80 細胞保存在有或沒有抗體（80 mg/ml）存在的條件下，而WT細胞要一直保存在有抗體的條件小16小時。然后，這些細胞在不含L-蛋氨酸但有500mmMCIL-甲硫氨酸S35(脈沖)（易標記）的DMEM培養(yǎng)基中處理20分鐘。在這之后，去處放射性標記的培養(yǎng)基，細胞用1ml磷酸鹽緩沖液鹽水洗兩次然后保存在有2mlI

15、SCOVE的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入2%FBS，在MV-DN30(80 mg/ml)存在或不存在脈沖3.6和16小時。之后，用免疫沉淀法（IP）在1ml細胞裂解液中進行測定（裂解緩沖液：1% TritonX-100存在下，20 mM Tris-鹽酸，5毫米EDTA，10% V / v甘油，150 mM NaCl補充蛋白磷酸酶抑制劑）通過使用抗Met ICD dq13單克隆抗體，而IP法利用抗Met ECD do24單克隆抗體對細胞培養(yǎng)2毫升上清液進行。細胞裂解液和上清液都在有已知抗體的培養(yǎng)基里培養(yǎng)16個小時，抗鼠IgG抗體預包被瓊脂糖凝膠蛋白珠形成免疫復合物沉淀下來。免疫沉淀物中的蛋白就會被8%

16、 SDS-PAGE 分開，然后轉(zhuǎn)移到3mm的紙上，80度，48小時后蛋白質(zhì)的放射性就會在投影膜上留下印記。2.4.生長和可行性分析用于細胞生長和可行性分析的這些細胞被接種在96孔的培養(yǎng)板上，根據(jù)制造商的說明用已知藥物在不同時期進行處理然后用細胞滴度發(fā)光細胞進行可行性分析。沒經(jīng)過處理的細胞控制在藥物載體存在的條件下生長。所有的數(shù)據(jù)進行歸一化到0天的藥物治療。2.5.熒光細胞分析對結(jié)合在EBC1WT,R20,R80細胞質(zhì)膜上的MET進行免疫熒光著色，這些細胞要提前在有或沒有MV-DN30存在的條件下培養(yǎng)24小時。熒光性的強度可以通過細胞熒光性分析檢測到。用于檢測的細胞要在PBS中用2%FBS洗滌并

17、且在室溫下用抗MET ECD DO24 mAb (100 ng/ml)著色20分鐘。然后在室溫下細胞又在PBS中用2%FBS洗滌就會逐步產(chǎn)生抗鼠IgG-RPE二抗然后用二脒基苯基吲哚作用20分鐘。作為陰性對照，將不含初級抗MET抗體的細胞進行染色。質(zhì)膜結(jié)合的蛋氨酸的熒光強度（AU為單位），通過使用GraphPad Prism軟件繪制為箱形繪圖圖表。2.6.慢病毒載體轉(zhuǎn)導EBC1 WT 細胞能穩(wěn)定地在兩種不同量的慢性病毒顆粒編碼的MET cDN轉(zhuǎn)導，包括1mg(METþþ)和1.6mg(METþþþ)的p24病毒抗原，其濃度按說明確定。作為對照，

18、WT細胞用含有空載體病毒顆粒感染 。MV-DN30抗性細胞(R20 and R80)只用空載體感染。在感染48小時后接種細胞用于生物化學分析。轉(zhuǎn)導細胞的可行性分析如先前描述的一樣進行，讓細胞在存在或不存在MV-DN30的條件下上長72小時。如先前所述，MET的蛋白印跡分析和磷酸化的MET蛋白水平和對感染細胞的mRNA的表達水平實時定量PCR分析一樣子細胞感染72小時后進行評估。2.7. 藥物協(xié)同作用分析在抗MET抗體MV-DN30和MET TKI JNJ-38877605之間進行藥物協(xié)同作用分析是對WT EBC1和接種在96孔板上的GTL16細胞在用藥物治療72小時后的細胞活力的研究。如果使用

19、一個藥品從藥物劑量來說要比混合使用的IC50約高10倍左右，雙重增加濃度可以用于單藥使用和組合使用。評估細胞活力為前面描述的增效作用的藥物效應多種分析研究，采用組合指數(shù)（CI）和Chou and Talalay 方法。使用相互排他性假設計算CI值（藥物作用機理的不同，采用compusyn.exe）軟件，可上線的網(wǎng)站： 1表明兩種藥物之間的協(xié)同作用。2.8. 統(tǒng)計分析同一個實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件進行兩尾t檢驗分析至少有三種生物學具有統(tǒng)計學顯著意義的結(jié)果。P值小于0.05被認為是有意義的。3.結(jié)果3.1. MV-DN30耐藥細胞株的建立EBC1 肺癌細胞是MET沉癮細胞，它能放

20、大MET的擴增、過度表達和活化過程。MET TKIs或者MV-DN30對EBC1細胞里的MET具有強烈的破壞它們生存和上長的能力的作用（圖AC）。我們先前培養(yǎng)的EBC1細胞 對不同的YKIs有抗性表明了這種抗性可能是由于MET基因的進一步擴增。為了產(chǎn)生抗MV-DN30的細胞，我們采用逐步暴露EBC1原代細胞不方法來增加抗體的濃度，并且獲得抗不同劑量抗體的細胞系（圖1b；約的分步方法詳見材料和方法部分）。, 進一步的實驗中，我們使用耐20細胞（ebc1 R20）和80（ebc1 R80）毫克/毫升mv-dn30，劑量是分別是前面的約10倍和40倍，然后測這些細胞的抗體IC50（圖1a）。在有MV

21、-DN30存在的抗性細胞的生長速度一直和WT細胞差不多（圖1C）。正如前面提到的，MV-DN30發(fā)揮它的抑制活性是通過誘導MET的結(jié)構(gòu)域蛋白反正溶蛋白裂解，隨后又通過蛋白酶體受體介導受體降解。這種反應減少了細胞表面的MET的大量表達，抑制了MET的活性和受體介導的生物學活性。如圖1D所示，事實上，MV-DN30的治療導致了再EBC1細胞中的MET通過酪氨酸酶的磷酸化消除大量減少。與抗性細胞的生化分析相反的是顯示了在相同劑量抗體存在的情況下，MET也會磷酸化并且在質(zhì)膜上的大量的MET蛋白明顯高于保存在相同條件下的WT細胞（圖1D,E）。除此，盡管激活的下游目標AKT和MAPK激酶都被保存在有抗體

22、存在的條件下（圖1D）。所有的數(shù)據(jù)表明，抗EBC1細胞的MV-DN30并不是通過一種足以消除它的結(jié)構(gòu)的活性的方法來下調(diào)MET，而是一種允許它的信號轉(zhuǎn)導來調(diào)節(jié)它的結(jié)構(gòu)磷酸化的方法.3.2.抗性細胞中缺乏MV-DN30抑制活性并不是因為它的活性不足 如圖1D,E所示，用MV-DN30處理抗性細胞致使MET大量減少這種減少比處于同等條件下觀察的WT細胞中的減少更明顯。我們想知道在抗性細胞里的抗體受損是否是由于MET的結(jié)構(gòu)域IPT4發(fā)生突變引起，這個結(jié)構(gòu)域是它的集合位點，但是我們沒有發(fā)現(xiàn)任何突變（數(shù)據(jù)顯示）。于是，我們評估了是否是抗性細胞中脫落的MET胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）對抗體的反應被抑制了。在相同劑

23、量MV-DN30存在的條件下培養(yǎng)了24小時的抗性細胞和WT細胞的上清液中，抗性細胞上清液中含有更豐富的脫落的ECD（圖2A）。當對去處抗體24小時后的抗性細胞中MET的表達和活化進行評估時，我們觀察到MET總量強烈增加特別是結(jié)合在細胞膜上的形式（圖2B和圖1）。 對抗性細胞再引入MV-DN30細胞會導致上清液中MET ECD含量更高，與在同樣劑量處理的WT細胞相比，之后細胞內(nèi)的MET同時減少了并返回到平時觀察的抗性細胞的一半水平（圖2 D）。在脈沖代謝標記實驗中也觀察到了相似的結(jié)果：比起WT細胞，抗性細胞合成更多的MET和MV-DN30來促進MET ECD 釋放并大量增加（圖2E）。最后， 用

24、更高劑量抗體20 mg/ml (R20)處理EBC1細胞來更好的證明MV-DN30在抗性細胞中是具有活性的。圖2F所示在抗性細胞中隨著MV-DN30劑量是增加減少了大量MET在細胞膜上的表達（圖2A）和磷酸化(圖2B)?？傊械慕Y(jié)果表明EBC1細胞的抗性不是因為MV-DN30活性缺乏，而是由于用它的飽和能力來促進了一種高效的MET解離。圖1- 抗MV-DN30的EBC1細胞分子表征。 (A) 在有MV-DN30的遞增濃度的條件下培養(yǎng)了72小時的EBC1 WT細胞的細胞活力。對未經(jīng)過處理的細胞(100%) ± s.d.的歸一化結(jié)果。 (B) 在指定濃度抗體的條件下培養(yǎng)72小時的EB

25、C1 WT細胞或產(chǎn)生MV-DN30抗性的細胞(R10, R20, R40, R80)。與未經(jīng)過處理的WT細胞(100%) ± s.d歸一化結(jié)果。 (C) 在MV-DN30(20 and 80 mg/ml)存在的條件下生長的EBC1 WT細胞EBC1R20和R80細胞的生長活性。與未經(jīng)過處理的WT細胞(100%) ± s.d歸一化結(jié)果(*P < 0.001)。(D) 在有指定劑量MV-DN30抗體存在的條件下處理24小時的EBC1WT ,EBC1R20和R80細胞的蛋白印跡。(E)結(jié)合MET的在24小時在不存在或存在的血漿膜的熒光強度的箱圖mv-dn30 R20和R80

26、生長EBC1 WT細胞（AU：任意單位）圖2細胞耐受性并不是由于失去了對MV-DN30的敏感性。(A) 在存在或不存在MV-DN30的環(huán)境下培養(yǎng)24小時的EBC1 WTR20和R80細胞的上清液中MET ECD的蛋白印跡。(B)在有或沒有（24小時去除）的EBC1WTR20和R80細胞中的蛋白（頂部）和蛋氨酸的酪氨酸磷酸化蛋白印跡。紐蛋白作為控制基礎(C)在 EBC1 WT, R20 and R80 細胞中有或沒有（24小時去除）MV-DN30的條件下在質(zhì)膜上結(jié)合的MET的熒光強度的箱圖。質(zhì)膜著色如圖E。 (D) 在用MV-DN30處理（24h）的EBC1WT R20和R80 細胞中和抗性細胞

27、（圖2 D）中觀察到的MET總蛋白水平和MET ECD 的蛋白印跡.(E) 在有或沒有MV-DN30存在下的EBC1WT和R80細胞里的MET(來源細胞裂解液，上面)和MET ECD（來源與細胞上清液，底部）的用脈沖追蹤代謝蛋白標記法的免疫沉淀分析。 (F) 在遞增MV-DN30濃度的環(huán)境下的EBC1(左圖)和R20細胞（右圖）的活性檢測。未經(jīng)過處理的WT細胞（左圖）或者用20 mg/ml (100%)處理的R20（右圖）統(tǒng)計結(jié)果(*P < 0.001, *P < 0.05)。3.3. 對MV-DN30的抗性是由于MET的擴增和過度表達如上圖所示（圖2BeD），MV-DN30抗性細

28、胞表達MET水平比原代細胞更高。我們懷疑這可能是由于增加的啟動子活性或更高的mRNA的可用性，因為你微RNA的負控制微分表達了。在EBC1WT和抗性細胞的熒光素酶檢測結(jié)果顯示排除這些可能性（數(shù)據(jù)未顯示）。然后我們評估了基因擴增的情況是因為MET大量復制是對激酶抑制劑存在抗性的機制。如圖3所示，EBC1抗性細胞顯示了MET的大量復制（原代細胞的第24代到30代），這大約是二倍體細胞的15倍。當分析MET的mRNA水平時，我們觀察到MET的過度表達是WT細胞的23倍，達到了MET正常表達細胞(A549 and HEK-293T)的6090倍。為了證明這種增加可能是為了維持對MV-DN30的抗性，我

29、們將EBC1WT細胞放在不同量的MET cDNA條件下轉(zhuǎn)導，通過比較EBC1R20和R80細胞mRNA的表達水平來獲得（圖3）。我們觀察到，MET的mRNA以23倍的速度劇增，這與在存在MV-DN30的條件下細胞的活性有關（圖3D）。除此，盡管有MV-DN30的存在MET保持磷酸化，這就解釋了為什么細胞能夠存活增加（圖3E）。所有實驗結(jié)果表明，嗜MET的EBC1細胞變得有抗性是因為MET的進一步擴增和過度表達從而來阻止有效的抗體介導的對MET活性的抑制。圖3 3.4. 抗MV-DN30的細胞也是嗜MET細胞并有藥物依賴性 為了證明抗MV-DN30的細胞也是嗜MET細胞，我們用一種小分子的激酶抑

30、制劑JNJ-38877605來處理細胞。如圖4a,b所示，抗MV-DN30的EBC1細胞在有抗體(20 mg/ml for R20 and 80 mg/ml for R80)存在的條件下生長情況顯示了當用MET激酶抑制劑JNJ-38877605 (10 nM or 250 nM)處理時，細胞活性的降低和MET磷酸化作用的減弱。和親代EBC1細胞相比，抗性細胞對JNJ-38877605的敏感劑量更低，可能是由于在抗性細胞中MET的蛋白合成和轉(zhuǎn)運更高效。從抗性細胞的培養(yǎng)基中去除MV-DN30會導致MET的表達增加（圖2B），我們研究了過度表達的生化效應?？剐约毎囵B(yǎng)在不存在MV-DN30的條件下，

31、顯示了活性下降（圖4C）。這些細胞的蛋白印跡分析表明，隨著時間的推移逐漸增加了磷酸化（圖4D）。然而，2448h后，after 24e48 h, p38 MAPK的活化清晰可見證明了通常在細胞凋亡反應之前會有一個細胞應激反應。除此之外，在沒有MV-DN30存在的條件下培養(yǎng)的抗性細胞中的p38 MAPK會受到一種小分子SB203580 的抑制使得細胞活性得以恢復（圖3）。這些數(shù)據(jù)進一步表明，p38 MAPK信號對于參與藥物依賴是至關重要的.重要的是要記住對于嗜MET細胞抗MET酪氨酸激酶抑制劑的藥物依賴條件和黑色素瘤有獲得性的藥物依賴性已經(jīng)被證明。為了證明當去除MV-DN30后過多的MET信號使

32、細胞凋亡是正確的，我們用低劑量的MET YKI處理抗性細胞讓其充分減少但不會完全抑制MET活性（圖4）。事實上，如圖4E所示，保存在不含MV-DN30并用 10 nM JNJ-38877605（低于IC50濃度）處理的抗性細胞可以恢復它們的活性，并且這種水平類似于保存在有抗體存在的培養(yǎng)條件下的抗性細胞的活性水平。總之，這些結(jié)果表明，MV-DN30抗性細胞都是嗜MET細胞并且它們的繁殖和生存都有藥物依賴性。圖43.5. 在嗜MET細胞中MV-DN30和MET TKIs的協(xié)同作用MET-TKIs 和 MV-DN30 都可以有效的抑制EBC1細胞的活性，我們想知道這兩種抗MET化合物是否表現(xiàn)增強或協(xié)

33、同作用。單獨或在有非常低劑量的MV-DN30存在的條件下（0.152.5毫克/毫升，從10倍以下的IC50開始），我們用逐步增加MET抑制劑JNJ-38877605的方法來處理EBC1 WT細胞。然后我們分析細胞活力和對藥物治療的兩種藥物的組合效應的性質(zhì)，利用多藥效果分析。如圖5C所示，聯(lián)合治療導致的劑量盡可能低為1.2520 nm jnj-38877605在0.152.5毫克/毫升mv-dn30存在活性降低。當在GTL16 WT 胃癌細胞上做這個實驗室會得到相似的結(jié)果（圖5D）。如圖5A、B所示，多藥效應分析表明了 EBC1 and GTL16 WT細胞的CI值都小于1，從而表明了JNJ-3

34、8877605和 MV-DN30之間有藥物協(xié)同作用.所有的這些數(shù)據(jù)表明用MET TKI和MV-DN30聯(lián)合治療可以有效地減少嗜MET細胞的活性，劑量明顯低于單獨一種藥物治療的藥量。圖5 4.討論臨床效應甚至是最有效的靶向治療都被發(fā)展的耐藥性所限制。顯而易見，這種耐藥性機制已經(jīng)被廣泛研究。從癌細胞和抗酪氨酸激酶抑制劑表明，獲得性耐藥的最常見的機制包括在藥物目標本身的二次突變的患者獲得的數(shù)據(jù)，激活下游信號轉(zhuǎn)導或平行的信號轉(zhuǎn)導通路的激活突變。 即使對關于癌癥是怎樣產(chǎn)生耐藥性抗體的了解很少，一些現(xiàn)象提示用抗EGFR 和抗HER2抗體治療的病人體內(nèi)有耐藥機制的建立。在EGER中的二次突變表明了免疫調(diào)節(jié)藥

35、物與EGFR的結(jié)合受到破壞從而調(diào)節(jié)了抵抗力。除此之外，最近的研究還證明了EGFR或HER2的信號轉(zhuǎn)導通路的激活可以分別繞過西妥昔單抗或曲妥單抗的抑制；這些包括EGFR配體水平增加，MET RTK的擴增或過度表達，下游或平行激活信號轉(zhuǎn)導途徑。在癌癥治療中MET受體已經(jīng)變成了最具關注的目標，因為很多研究表明，MET在多種人類腫瘤中具有組成性活性。它的失調(diào)可能是由于不同的機制包括過度表達，基因擴增，激活突變和受體介導的刺激自分泌或旁分泌的增加。生殖細胞的激活突變的識別和遺傳型腎乳頭狀癌直接證明了MET和人類腫瘤發(fā)生有關的概念。MET的酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域中激活突變位點已經(jīng)在散發(fā)腫瘤中確定。然而，在人類

36、癌癥中變化頻繁的是轉(zhuǎn)錄表達的過程，這個過程是由原癌基因激活誘導抑癌基因失活和對特定的為mRNA或缺氧刺激的下調(diào)過程。在原發(fā)性腫瘤中由基因擴增引起的MET過度表達是少見的，但在肺癌和結(jié)腸癌中變得抗靶向其它RTKs治療的情況更頻繁。臨床證據(jù)表明癌細胞是沉溺在原癌基因中的細胞，在這種細胞中的MET具有組織性活性并且它們的抑制結(jié)果就是使其致瘤性被破壞。然而，用小劑量的激酶抑制劑延長對嗜MET細胞的處理會導致二倍抗性的出現(xiàn)，這種機制可以被維持比如MET擴增或突變,KRAS的擴增或EGFR家族成員的活化。在我們的研究中表明,在嗜MET細胞中對MET特定抗體MV-DN30的抗性獲得是由于MET復制數(shù)量的大量增加。這一現(xiàn)象的機理解釋依賴于染色體外的MET復制的動態(tài)調(diào)節(jié)，造成了一種癌癥對治療的適應性程序。MET上調(diào)的增加是由于MET基因擴增造成的這種現(xiàn)象并不明顯當抗性細胞培養(yǎng)在有抗體（這種抗體介導了MET的下調(diào)）存在的條件下，但是在沒有這種抗體存在的條件卻是很明顯清晰的。我們觀察到蛋白的增加平行下來是METmRNA增加的23倍。EBC1 原代細胞的METcDNA的轉(zhuǎn)導可以達到一個和抗性細胞一樣是表達水平，證明了事實上細胞表達更多的MET可以減少