臨床實驗室中的質(zhì)譜分析和質(zhì)譜儀

1、臨床實驗室中的質(zhì)譜分析和質(zhì)譜儀 整整100年（1912）以前，英國科學(xué)家Thomson（Joseph John Thomson）憑借對不同質(zhì)量成分進(jìn)行分離的方法證明了氖氣是由兩種同位素構(gòu)成的，這是首次提出了質(zhì)譜（質(zhì)量譜）的概念，同時也是首次實驗證明了穩(wěn)定同位素存在。在此后的100年中質(zhì)譜分析及執(zhí)行質(zhì)譜分析的質(zhì)譜儀有了劃時代的的發(fā)展，從一項只有在資深科學(xué)家實驗室中才可能掌握的技術(shù)逐漸演變成了可以廣泛使用的分析技術(shù)。在100年的進(jìn)程中，項技術(shù)的重要性日益顯現(xiàn)，也因此有6位科學(xué)家先后由于對質(zhì)譜分析的突出貢獻(xiàn)而榮獲諾貝爾獎。 色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用在質(zhì)譜分析的發(fā)展中具有重要的意義。首先是從1968年開始?xì)庀?/p>

2、色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用（GC-MS）革命性地改變了對揮發(fā)性化合物的分析的水平，到了上世紀(jì)80年代高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的實現(xiàn)，又促成了對非揮發(fā)性化合物分析水平的重大進(jìn)步，從而實現(xiàn)了另一次飛躍。隨之而來的技術(shù)的發(fā)展也使早年主要用于小分子量化合物分析的質(zhì)譜演變成可對極大分子量的生物大分子進(jìn)行分析，本世紀(jì)初已有報道顯示了對完整病毒顆粒的質(zhì)譜分析（分子量約40.5MDa）。此外，在質(zhì)譜的分辨率、準(zhǔn)確度、靈敏度方面也完成了數(shù)個數(shù)量級的提高。 半個多世紀(jì)以前，質(zhì)譜開始被應(yīng)用于有機化學(xué)，并逐漸成為有機分析中最重要的手段之一。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，最先用上質(zhì)譜的是與有機化學(xué)密切相關(guān)的藥物化學(xué)，成為在藥物分析、藥物代謝等方面

3、的研究中必不可少的武器，但是這還并不是裝備在以直接服務(wù)于臨床、以常規(guī)分析為主的臨床實驗室中。最早進(jìn)入臨床實驗室的質(zhì)譜儀是GC-MS，在上世紀(jì)80年代初GC-MS開始被引入臨床實驗室，主要用于分析尿液中的代謝物以監(jiān)測新生兒先天性代謝異常。大約20多年后，更為實用、高效、應(yīng)用更為廣泛的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）進(jìn)入了臨床實驗室，成為臨床實驗室發(fā)展的潮流及日益重要的裝備。另外，電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）對體液中痕量元素的測定、最近發(fā)展起來的用于病原微生物檢定的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）等也開始愈來愈多的出現(xiàn)在臨床實驗室。一、質(zhì)譜分析的工作原理 質(zhì)譜

4、的工作原理是令帶電的顆粒通過磁場，使得具有不同質(zhì)荷比（m/z）的成分得到分離，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)分子的測定。因此分析的第一步必然是需將待分析的化合物（M）轉(zhuǎn)變成氣相的離子，有多種方法可完成這一轉(zhuǎn)變，下面的反應(yīng)式是以電子電離的法為例：M + e? M?+ + 2e? 上式中M表示待分析的化合物，它在電子的作用下形成活化態(tài)的陽離子（M?+），M?+也可以進(jìn)一步在化學(xué)鍵處斷裂形成碎片，隨后將這一系列轉(zhuǎn)變中形成的產(chǎn)物按照其質(zhì)荷比加以分離并將測定結(jié)果顯示出來，這就是質(zhì)譜圖，分析結(jié)果也可以用列表的形式表現(xiàn)。下圖及列表就以一個簡單化合物-甲醇為例，說明質(zhì)譜分析的原理。 圖一中（或表列中）顯示了一系列不同質(zhì)荷比的

5、譜峰，這其中有兩個譜峰更為重要。一個是基礎(chǔ)峰（Base peak），也即譜圖中最高的峰，在甲醇的例子中是m/z為31的峰，相應(yīng)為CH3O+的片段，因為峰高代表了每個成分的的濃度，這個最高的譜峰就設(shè)定為100%，其他的峰都表示為與它相比的百分?jǐn)?shù)，如此就可以得到了各個成分的相對豐度。另一個重要的峰是分子離子峰（molecular ion peak），即甲醇分子電離后未被進(jìn)一步打碎的成分所形成的譜峰,在此圖中為m/z等于32的譜峰，相應(yīng)為CH3OH-?+ 。其它的譜峰代表了不同化學(xué)鍵斷裂的結(jié)果，如m/z為15的譜峰表示了CH3的存在。由于同位素的存在，在分析結(jié)果中還有m/z為33譜峰，它的出現(xiàn)是由于

6、C13同位素的存在。二、質(zhì)譜儀 進(jìn)行質(zhì)譜分析的儀器稱作質(zhì)譜儀。通過上述對質(zhì)譜分離原理的了解，可以知道質(zhì)譜儀雖然有許多不同的設(shè)計，但都是由實現(xiàn)如下基本功能的結(jié)構(gòu)組成： 1.將樣品分子生成離子（離子源）； 2.按照m/z的大小對離子進(jìn)行分離（質(zhì)量分析器）； 3.對選定的離子進(jìn)行破碎并在下一個質(zhì)量分析器重再進(jìn)行分析（串聯(lián)質(zhì)譜具有的功能）； 4.將分離后的離子轉(zhuǎn)變成電信號并測量其豐度（檢測器）； 5.處理信號、顯示結(jié)果、控制儀器（電腦）。離子源： 多種離子化技術(shù)可被使用在質(zhì)譜儀中，針對被分析物的性質(zhì)和考慮到離子化過程中內(nèi)部能量的傳遞可選擇不同的離子化技術(shù)。例如電子電離、化學(xué)電離、場電離僅適用于易揮發(fā)、

7、熱穩(wěn)定的化合物；對于熱不穩(wěn)定及不易揮發(fā)的化合物就需要能直接將這些化合物提取到氣態(tài)的方法。這種直接的離子源有兩類：液相離子源和固相離子源。在液相離子源中被分析物是處于溶液中，需將溶液霧化并在大氣壓中中形成離子，然后在真空的作用子下迫使離子進(jìn)入分析器，這類離子源有電噴霧（Electro-spray， ESI）、大氣壓中化學(xué)電離（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI）等。在固相離子源中，被分析物處于不揮發(fā)的沉積狀態(tài)，這種沉積狀態(tài)可由各種制備方法產(chǎn)生，其制備過程經(jīng)常會涉及引入一種固體或非揮發(fā)性液體做為基質(zhì)，被分析化合物的沉積隨后經(jīng)高能粒子或光子照射

8、使沉積物表面的離子釋放出來并在電場的作用下進(jìn)入分析器，這類離子源有基質(zhì)輔助激光解析（Matrix-assisted laser desorption）、等離子體解析(Plasma desorption)離子源等。質(zhì)量分析器 質(zhì)量分析器可由不同的原理發(fā)展而成。大致而言它們可以分為兩類，一類是以時間的尺度將不同質(zhì)荷比的離子進(jìn)行分離，例如四級桿質(zhì)譜；另一類則是以空間的尺度將不同質(zhì)荷比的離子進(jìn)行分離，例如離子阱質(zhì)譜。當(dāng)然分類也可以用質(zhì)量分析器的其他性質(zhì)，比如脈沖式的或是連續(xù)式的等等。隨著儀器的發(fā)展，也出現(xiàn)許多將不同的質(zhì)量分析器聯(lián)用的組合，例如四級桿-飛行時間（Quadrupole-TOF）等。當(dāng)評價一

9、臺質(zhì)譜儀的性能，一般會考慮到以下這些因素：可分析的質(zhì)量區(qū)間、分析速度、傳送能力（進(jìn)入分析器與到達(dá)檢測器離子的比例）、質(zhì)量準(zhǔn)確度和分辨度。表一列出了某些常用質(zhì)量分析器的基本特征。 兩個或數(shù)個質(zhì)量分析器可被串聯(lián)起來使用，使得在前級質(zhì)量分析器中的選定碎片在后一級質(zhì)譜中得到進(jìn)一步分析，這樣的質(zhì)譜被稱為串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS或MSn）。也可以將色譜（氣相或液相）連接在離子源的前端做為樣品的輸入裝置，使得色譜的分離能力與質(zhì)譜的分離鑒定能力得到疊加，被稱為色質(zhì)聯(lián)用（GC-MS或LC-MS）,聯(lián)用的質(zhì)譜部分自然也可以是串聯(lián)質(zhì)譜。目前臨床實驗室中最常用的質(zhì)譜就是液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）。檢測器和

10、電腦 檢測器的作用在于使通過質(zhì)量分析器的離子產(chǎn)生電信號（電流），此電流的強度與其豐度成比例。對離子的測定無非總是根據(jù)其電荷、質(zhì)量或是速率。由于在每個特定時間點上由質(zhì)量分析器中出來的離子有限，其所形成的電流也十分有限，因此其后部都連有放大電路。檢測器與質(zhì)譜的其他部件一樣仍處于不斷發(fā)展之中以應(yīng)對新的需求，例如測定質(zhì)量很大的離子。 電腦在質(zhì)譜分析中的基本作用與許多分析儀器基本相同，主要有三個功能：控制儀器、獲取和加工分析資料集對數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀，從而最后向用戶輸出一份分析結(jié)果的報告。這其中涉及到模數(shù)信號的轉(zhuǎn)換、分析過程中的取樣頻率與分析質(zhì)量的關(guān)系，用戶也應(yīng)該對所用數(shù)據(jù)庫的特點有所了解，以便對電腦給出的分

11、析結(jié)果有正確的解讀。三、質(zhì)譜在臨床實驗室中的主要應(yīng)用（1）治療藥物濃度檢測（TDM） 同樣的藥物用在不同病人身上效果往往是有差異的，這里面有遺傳的因素也有環(huán)境的影響，其主要的表現(xiàn)則為代謝上的差異。對病人用藥后血藥濃度的檢測將大大提高用藥的合理性并避免或減少副作用的出現(xiàn)。圖二顯示了血藥濃度檢測的基本概念。 圖中的曲線顯示了連續(xù)用藥后血藥濃度的變化：每次用藥后血藥濃度在較快的上升至最大濃度后逐漸下降，至一定的水平后給予第二次用藥。合理的用藥應(yīng)該注意到兩點：一是血藥濃度的最高水平不得超越藥物的毒性水平；二是后繼用藥必需在不低于該藥物的最低有效水平前給予。具有下列特點的藥物最應(yīng)該進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測：毒性

12、大而且毒性水平與有效濃度之間區(qū)間窄的藥物；個體間藥代動力學(xué)差異大的藥物；需長期使用的藥物?；蚴沁€有一條：價格昂貴的藥物。 用于器官移植等病情的免疫抑制劑是符合上述需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測的一個很好的例子。上世紀(jì)八十年代出現(xiàn)的環(huán)孢霉素（Cyclosporine）大大提高了器官移植的成功率并明顯延長了接受器官移植者的生命。環(huán)孢霉素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是一種親脂性的多肽，溶解性差也不易吸收，其有效的血濃度范圍很窄，每位病人對環(huán)孢霉素的吸收能力差異性很大，形成劑量高會造成對腎臟的毒性，劑量低則不能抑制排斥的出現(xiàn)，檢測和控制血藥濃度是必要的治療手段。繼環(huán)孢霉素之后又研發(fā)出一些有效的免疫抑制劑，如他克莫司（Tacro

13、limus，F(xiàn)K506）、西羅莫司（Sirolimus）、依維莫司（Everolimus）等，用藥時也都有進(jìn)行血藥濃度檢測的需求。 以針對某種藥物的抗體為基礎(chǔ)發(fā)展起來的血藥濃度檢測曾是廣為使用的檢測技術(shù)，但近年來發(fā)展成功的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)越來越成為主流的檢測手段。主要的原因是：質(zhì)譜可以準(zhǔn)確地針對原藥分子，而不像免疫測定難以避免的會與原藥的某些代謝產(chǎn)物出現(xiàn)交叉反應(yīng)；質(zhì)譜法可以同時檢測到多種藥物的血藥水平（如數(shù)種免疫抑制劑，圖三）；快速簡便。 表二列出除免疫抑制劑以外，其他值得用LC-MS/MS進(jìn)行治療藥物濃度檢測的一些例子。(2)與疾病相關(guān)體液成分的檢測 體液各種成分的種類和含量與人體的健

14、康水平密切相關(guān)，也往往反映疾病的是否存在或是病情輕重的指標(biāo)。了解體液特定成分的含量或全面掃描體液中的各種成分來反映機體的健康狀況是多年來醫(yī)學(xué)檢驗界努力追求的目標(biāo)。質(zhì)譜分析可同時檢測多種靶標(biāo)及其快速、準(zhǔn)確的特點使它必然成為一種有極大潛力的醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)。 質(zhì)譜目前在這一領(lǐng)域最為廣泛使用的是對新生兒遺傳代謝病的篩選。新生兒遺傳代謝病是指一組包含多種涉及到多種氨基酸代謝、脂肪酸代謝及有機酸代謝的隱性遺傳病，由父母雙方遺傳給后代，遺傳缺陷的所在位置分別是各種代謝環(huán)節(jié)中的催化劑-酶。其中發(fā)病率比較最高的是苯丙酮尿癥（根據(jù)德國、美國、卡塔爾、日本共70多萬例的篩選結(jié)果，苯丙酮尿癥的發(fā)病率約為7.8/十萬人，

15、另據(jù)一份報告對中國調(diào)查的結(jié)果是大約為18000個新生兒中出現(xiàn)一例）。苯丙酮尿癥發(fā)病的原因是由于在12號染色體長臂上編碼苯丙氨酸羥化酶的基因（PAH）出現(xiàn)畸變，導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶的功能下降，使苯丙氨酸難以代謝成酪氨酸。這將一方面使苯丙氨酸聚集造成神經(jīng)系統(tǒng)等方面的毒性，另一方面又由于酪氨酸的缺乏使其形成神經(jīng)介質(zhì)及色素等方面的功能被削弱。盡早的治療（主要是飲食控制）有可能恢復(fù)病兒的正常成長，喪失治療時機則不免形成終身殘障。圖四顯示了苯丙酮羥化酶的催化作用，這一催化作用的受損將是苯丙酮尿癥的起因。 除了苯丙酮尿癥外，還有幾十種有遺傳代謝病，例如在中國人中發(fā)病較多的甲基丙二酸血癥等等。這些疾病雖然在發(fā)病

16、機制中涉及的酶各不相同，但有一些共同的特點：（1）發(fā)病的早期癥狀類同；（2）如發(fā)病早期得不到及時的治療，轉(zhuǎn)歸會十分兇險，例如發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙或生命夭折；（3）大部分疾病如能得到早期診斷和治療，會有明顯的治療效果。LC-MS/MS由于具有快速對多個靶標(biāo)（約60個）同時進(jìn)行檢測的能力，是目前最為有效的對這組疾病的篩選檢測方法。 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）2012年發(fā)布的有關(guān)用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行新生兒篩查的指南（ISSN 0273-3099）建議檢測的疾病列于表三。 除了上述的測定外，LC-MS/MS在測定25-羥基維生素D、雌激素、睪丸激素、肌酸、溶酶體酶活力分析等方面有較為廣泛地應(yīng)用，

17、這方面應(yīng)用的擴展肯定會不斷持續(xù)。（3）電感耦合等離子體質(zhì)譜測定微量元素 電感耦合等離子體質(zhì)譜的質(zhì)譜部分其實與其他質(zhì)譜技術(shù)是相似的，常用的有四級桿質(zhì)譜，其特點在于等離子體離子源，這種離子源與LC/MS或GC/MS所用的低能離子源是十分不同的。等離子體離子源有極高的溫度使得任何分子結(jié)構(gòu)都被破壞，因此測定的對象只有元素的離子。這項技術(shù)始發(fā)于上世紀(jì)八十年代，最早的商業(yè)化的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀出現(xiàn)在1983年。電感耦合等離子體質(zhì)譜可以測定元素周期表中的大多數(shù)元素，靈敏度介于1ppt上下。電感耦合等離子體質(zhì)譜在多個領(lǐng)域中都有重要的應(yīng)用，也包括在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。目前已有一些醫(yī)院裝備了電感耦合等離子體質(zhì)譜

18、，用于有害金屬離子（如鉛、汞）及各種微量元素的測定及治療藥物監(jiān)測（如對含鉑的抗腫瘤藥）等方面。（4）病原微生物檢測 病原微生物的檢定是醫(yī)學(xué)診斷中一個歷史悠久的項目，對正確診斷的確立和有效治療的執(zhí)行有重要的作用。多種技術(shù)途徑都對微生物的檢定做出貢獻(xiàn)，形態(tài)學(xué)觀察、代謝途徑檢測、基因組分析等都在不同的歷史時期中進(jìn)入這一領(lǐng)域，也仍然在不同條件下持續(xù)發(fā)揮著作用。從上世紀(jì)九十年代開始，利用MALDI-TOF質(zhì)譜通過對微生物蛋白質(zhì)指紋譜的分析來檢定微生物開始進(jìn)入人們的視野，并在近年有制造商推出了商業(yè)化的專用儀器。 這是一項需由質(zhì)譜分析與生物信息分析及資料庫緊密聯(lián)系的應(yīng)用項目，由于它在醫(yī)學(xué)診斷與治療、環(huán)境控制

19、、甚至防衛(wèi)措施等方面的前景，近年來產(chǎn)生了大量的研究報告，前景是值得期待的。但也由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、離子源中的介質(zhì)、樣品的制備方法等因素都會對指紋產(chǎn)生影響，更多有關(guān)穩(wěn)定重演性等方面的研究仍在積累。四結(jié)語與前景 本文介紹了質(zhì)譜的基本原理及在臨床實驗室中應(yīng)用的概況，涉及的內(nèi)容較多地偏重于LC-MS/MS，因為LC-MS/MS目前在臨床實驗室中已經(jīng)較為普及，并存在進(jìn)一步發(fā)展的廣闊前景。GC-MS是最早應(yīng)用于臨床實驗室的質(zhì)譜技術(shù)，目前在新生兒代謝病的診斷等方面也仍在應(yīng)用，但基于GC對分析樣品的局限性，其進(jìn)一步擴展的余地自然會有所限制。 個性化醫(yī)療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個趨勢，對特定靶標(biāo)分子的檢測是其中重要

20、的內(nèi)容。質(zhì)譜可以同時對多個靶標(biāo)分子的快速準(zhǔn)確測定是這項技術(shù)的一個固有的優(yōu)勢。除了對多種藥物、體液組成中小分子的測定會繼續(xù)擴展外，對多種蛋白質(zhì)（多肽）分子測定方法也會日益成熟，用抗體對靶標(biāo)分子的測定已使用多年，質(zhì)譜的多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（Multiple reaction monitoring, MRM）由于能同時準(zhǔn)確地檢測多個靶分子，在臨床實驗室中會有很大的發(fā)展空間。 質(zhì)譜在臨床實驗室中更廣泛地應(yīng)用，還取決于儀器的發(fā)展和人員的培訓(xùn)。在過去的十年中，儀器的性能已經(jīng)有了很大的突破，這種趨勢肯定會持續(xù)，同時也會出現(xiàn)更加友善的操作界面。由于認(rèn)識到質(zhì)譜分析將大大提高醫(yī)學(xué)檢驗的服務(wù)內(nèi)容和準(zhǔn)確程度，醫(yī)學(xué)檢驗界的資深科學(xué)家與有識之士紛紛大力推動質(zhì)譜在這一領(lǐng)域的普及，一支有能力的隊伍正在形成。 可以預(yù)期，在未來5-10年內(nèi)，質(zhì)譜在臨床化學(xué)中肯定還會有長足的發(fā)展。主要參考文獻(xiàn)： 1.Clinical Application of Mass Spectrometr