吸附百日咳菌苗白喉破傷風(fēng)類毒素混合制劑制造及檢定規(guī)程

1、吸附百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑制造及檢定規(guī)程本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉類毒素及精制破傷風(fēng)類毒素用氫氧化鋁吸附制成。供兒童預(yù)防百日咳、白喉及破傷風(fēng)之用。1抗原要求1.1百日咳菌苗原液應(yīng)符合附錄1百日咳菌苗原液制造及檢定要求中2.4項的規(guī)定。1.2精制白喉類毒素應(yīng)符合吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程中4項的要求。1.3精制破傷風(fēng)類毒素應(yīng)符合吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程中4項的要求。2制造2.1配方每ml制劑中各種抗原成份含量如下：百日咳菌45億90億精制白喉類毒素20Lf精制破傷風(fēng)類毒素5Lf2.2吸附劑配制，見吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程5項。2.3氫氧化鋁稀釋以蒸

2、餾水按吸附后之總量將氫氧化鋁原液稀釋成1.01.5mg/ml。硫柳汞含量不超過0.01%（g/ml），氯化鈉含量補足至0.85%（g/ml），高壓蒸汽滅菌。2.4吸附按計算量將精制白喉類毒素、精制破傷風(fēng)類素及百日咳菌苗原液加入稀釋好的吸附劑內(nèi)。調(diào)節(jié)pH至5.87.2。2.5分批同批吸附劑同批配合的原液同次吸附的制品為1批。如用大罐吸附時，所用抗原和吸附劑可以多批混合（精制類毒素不超過3批），每罐為1批。3成品檢定3.1物理化學(xué)檢查3.1.1振搖后應(yīng)呈均勻乳白色混懸液。不應(yīng)有搖不散的凝塊或異物。3.1.2pH值應(yīng)為5.87.2。3.1.3氯化鈉含量為0.75%0.9%(g/ml)。3.1.4硫柳

3、汞含量為1.0%0.5%(mg/ml)。3.1.5硫柳汞含量不超過0.01%(g/ml)。3.2鑒別試驗抽取樣品，另枸櫞酸鈉或用其他適宜方法將吸附劑溶解后，離心沉淀百日咳菌體和殘留的吸附劑，按吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程中7.6項、吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程中7.6項和附錄1百日咳菌苗原液制造及檢定要求中2.4.3項進行鑒別試驗。3.3無菌試驗按生物制品無菌試驗規(guī)程進行。3.4毒性試驗應(yīng)符合附錄1百日咳菌苗原液制造及檢定要求中2.4.5項的規(guī)定。3.5安全試驗3.5.1小白鼠法用體重1820g之健康小白鼠5只，每只皮下注射檢品0.5ml觀察7日，不得有局部膿腫或死亡。3.5.2豚鼠

4、法用體得300400g豚鼠，每批制品不少于4只，每只皮下注射2.5ml，分兩側(cè)，每側(cè)1.25ml，應(yīng)符合吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程中4.4項及吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程中4.5項要求。3.6效力試驗3.6.1百日咳菌苗免疫力試驗每3批抽1批進行，應(yīng)符合附錄1百日咳菌苗原液制造及檢定要求中1.2.5項的規(guī)定。3.6.2白喉及破傷風(fēng)類毒素的效力試驗每更換1批類毒素時進行。取體重300400g豚鼠4只，每只皮下注射0.5ml，第30天采血，將分離的血清等量混合，進行白喉及破傷風(fēng)抗毒素單位測定。3.6.2.1白喉抗毒素單位測定用Lr/300家兔皮內(nèi)法，要求每ml血清達到0.25IU。3.

5、6.2.2破傷風(fēng)抗毒素單位測定用L+/100小白鼠皮下法，要求每ml血清達到0.5IU。3.6.2.3白喉類毒素的效力試驗亦可采用攻毒法。取體重300350g豚鼠5只以上，每只皮下注射0.5ml。第30天各皮下攻擊白喉毒素200個MLD，觀察7天，豚鼠死亡不得超過20%；同時另取體重240270g豚鼠3只，各皮下注射1個MLD毒素作為對照，2只對照豚鼠應(yīng)發(fā)病并于96小時內(nèi)死亡，允許另1只較晚死亡或發(fā)病。3.6.2.4亦可按WHO推薦的效力檢定方法（見吸附精制白喉類毒素制造及檢定規(guī)程附錄和吸附精制破傷風(fēng)類毒素制造及檢定規(guī)程附錄）。4保存與效期應(yīng)保存于28。自吸附之日起效期為1年半。附錄1百日咳菌

6、苗原液制造及檢定要求本品系用百日咳第相菌種經(jīng)培育后取菌體制成懸液，加適當(dāng)殺菌劑，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋制成，每ml含菌45億90億。用于制備百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑。1菌種1.1制造百日咳菌苗之菌種、檢定用的相診斷血清、百日咳分型血清及百日咳參考菌苗，由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2菌種檢定1.2.1培養(yǎng)特性于包-姜（Bordet-Gengou）氏或其他適宜的培養(yǎng)基上培育，各菌株應(yīng)具有典型的形態(tài)及生化特性。1.2.2血清學(xué)特性將3537培育4048小時的菌苔，混懸于生理鹽水或磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，使每ml含菌20億個，與相血清做定量凝集反應(yīng)，凝集效價應(yīng)達到血清原效價

7、之半。同時與單價分型血清做定量凝集反應(yīng)，其型別應(yīng)與該菌種標(biāo)定型別相同。1.2.3皮膚壞死試驗用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育4048小時的菌苔混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，然后稀釋為幾個不同濃度的菌液，分別用每一稀釋度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮內(nèi)0.1ml，經(jīng)72小時觀察反應(yīng)。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4億個菌以下的菌液部位出現(xiàn)出血性壞死者為陽性反應(yīng)，判為合格。1.2.4毒力試驗用體重1618g之小白鼠至少3組，每組至少10只，在麻醉狀態(tài)下從鼻腔滴入經(jīng)培育4048小時，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋的菌液0.05ml觀察14天，記錄小白鼠生死情況，按ReedMuench法計算LD50，LD50菌

8、數(shù)不超過1.2億判為合格。1.2.5免疫力試驗1.2.5.1方法按附錄2百日咳菌苗原液免疫力試驗方法進行。1.2.5.2判定試驗菌液每個接種劑量的免疫效價應(yīng)不少于4.0IU。若試驗菌液的效價低于此要求時，可復(fù)試，其結(jié)果的幾何平均值（如用概率分析法時，應(yīng)用加權(quán)幾何平均值）4.0IU，仍判為合格。1.3菌種保存1.3.1菌種應(yīng)用凍干法保存。1.3.2凍干菌種應(yīng)保存在28。凍干后抽樣按1.2項進行檢查，合格的菌種可使用2年，以后每年檢查1次，如仍合格可繼續(xù)使用1年。2.制造2.1制造百日咳菌苗原液至少應(yīng)選用2個菌株，制成的菌苗應(yīng)含1、2、3型因子。2.2制造百日咳菌苗原液用活性炭半綜合培養(yǎng)基或其他適

9、宜的培養(yǎng)基。如用液體培養(yǎng)基，不得含有已知引起人體毒性或變態(tài)反應(yīng)的成分。2.3原液制造2.3.1菌種凍干菌種啟開后接種于改良包-姜氏或活性炭半綜合培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基上。于3537培育不超過72小時，以后各代不超過48小時，傳代菌種保存不得超過14天，凍干菌種啟開后用于生產(chǎn)時不應(yīng)超過10代。2.3.2培育可用固體法或液體法培育。培育時間不得超過48小時，經(jīng)檢查為純菌后，用適當(dāng)方法收集菌體，混懸于pH值為7.07.4的磷酸鹽緩沖生理鹽水中。2.3.3殺菌原液可用不超過0.1%（ml/ml）甲醛溶液殺菌，放3723天。亦可用其他適宜的殺菌劑和殺菌方法殺菌。2.3.4純菌試驗原液應(yīng)逐瓶（罐）抽樣接

10、種普通瓊脂斜面及普通血液瓊脂斜面（或活性炭半綜合培養(yǎng)基）各1管，放3537培育2天，然后放24261天。有雜菌生長者應(yīng)廢棄。2.3.5原液合并固體法工藝生產(chǎn)經(jīng)純菌試驗合格的原液應(yīng)進行合并。不同菌株不同日期制造2的原液應(yīng)分別合并。合并后，可加適量防腐劑，并保存于28。2.4原液檢定2.4.1濃度測定每瓶原液應(yīng)按中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量檢定部門會同測定濃度。稀釋菌苗時即按此濃度計算。2.4.2鏡檢每瓶原液取樣稀釋至成品濃度，涂片染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陰性球桿菌。至少觀察10個視野，應(yīng)無雜菌。2.4.3凝集反應(yīng)每瓶原液按1.2.2項與相血清做定量凝集試驗，其凝集效價應(yīng)達血清原效價之半，如僅達到或低于血清

11、原效價1/4時，應(yīng)作免疫力試驗，合格后方可使用；同時應(yīng)用單價分型血清做定性凝集試驗，其所含型別應(yīng)與制造原液的菌種型別相同。2.4.4無菌試驗每瓶原液除按生物制品無菌試驗規(guī)程進行無菌試驗外，并做特異無菌試驗。如特異無菌試驗有百日咳菌生長，可復(fù)試一次，若仍有百日咳菌生長，原液應(yīng)判為不合格。2.4.5毒性試驗2.4.5.1方法按附錄3百日咳菌苗原液毒性試驗方法進行。2.4.5.2判定試驗組小白鼠注射后72小時的總體重不少于注射前總體重，第7天小白鼠增加的體重不少于對照組增加體重的60%，并不得有死亡，該批原液毒性試驗判為合格。試驗結(jié)果達不到上述要求，可復(fù)試一次。仍達到不過要求，可將原液放置1.2.5

12、項方法及要求進行。2.5原液保存應(yīng)保存于28。原液自采集之日起至成品發(fā)出不得少于4個月。原液自采集之日起效期為3年。附錄2百日咳菌苗原液免疫力試驗方法1免疫1.1動物選用體重1012g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。將動物隨機分為三組，每組16只或20只（同性或雌雄性各半，為保證攻擊后有16只或20只小白鼠，可適當(dāng)多免疫幾只小白鼠），同時飼養(yǎng)健康小白鼠55只，備做對照用。1.2免疫原稀釋將百日咳原液用生理鹽水或pH7.30.1磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2，然后再稀釋7.5、37.5、187.5，百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU，然后再稀釋成每ml含1.0IU（0.125m

13、l）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。1.3免疫方法將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。2攻擊菌及攻擊菌液的制備2.1菌種小白鼠腦內(nèi)攻擊用58030（18323）菌株。2.2培養(yǎng)基可用包-姜氏培養(yǎng)基（含羊血20%30%）或其他適宜的培養(yǎng)基。2.3培養(yǎng)溫度及時間放3537培育，第一代不超過72小時，攻擊時菌種的培育時間為2024小時。原代菌種放28可保存2周。2.4攻擊菌液的制備將培育2024小時的菌苔經(jīng)肉眼檢查為純菌后，刮入生理鹽水或pH7.30.1緩沖生理鹽水，用滅菌脫脂棉過濾，測定濃度，然后用pH7.07.2水解酷素、蛋白胨水或

14、肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬，作為試驗組的攻擊菌液，然后再連續(xù)稀釋，使每0.03ml分別含8000、800、80及8個菌，以上5個不同稀釋度的菌液，作為對照組的攻擊菌液。2.5工作起止時間自攻擊菌液制備（開始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超過2.5小時。2.6活菌計數(shù)在攻擊前后，可將0.03ml含8個菌的攻擊菌液，接種于包一姜氏培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基平皿中，每個平皿0.2ml，每次不得少于2個平皿，其菌落形成單位約為濁度測定的1/4。3攻擊動物免疫后14天，每只小白鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml菌液（含8萬個菌），用0.25ml注射器，4號針頭。在試驗組攻擊后再進行對照組毒力測定，對照組每稀釋

15、度攻擊10只小白鼠。4記錄結(jié)果動物攻擊后觀察14天。攻擊后第2天，將試驗組動物處理成每組16只或20只。以后逐日觀察動物并記錄死亡數(shù)，最初3天死亡的動物不作統(tǒng)計，至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動物按死亡計算。5結(jié)果計算5.1按Wilson-Worcester氏法計算參考菌苗及待檢菌苗的ED50SD%，每個ED50標(biāo)準(zhǔn)差的范圍一般應(yīng)為64%156%。5.2按Reed-Muench氏法計算對照組LD50，1個LD50的菌數(shù)應(yīng)不高于800個菌。5.3計算均質(zhì)性因子“”。5.4IU計算待檢原液每ml應(yīng)含IU=參考菌苗ED50/待檢原液ED50參考菌苗每ml的IU數(shù)6效力評價百日咳原液按成

16、品菌苗嘗試稀釋后，每個接種劑量的免疫效價應(yīng)不少于4.0IU。附錄3百日咳菌苗原液毒性試驗方法1選用體重1416g健康小白鼠，每批原液不少于10只（同性或雌雄性各半）。2以滅菌生理鹽水或pH7.30.1磷酸鹽緩沖生理鹽水（含成品菌苗相同量的防腐劑），將百日咳原液稀釋至成品菌苗濃度的1/2。3每只小白鼠腹腔注射稀釋的原液0.5ml。另取同數(shù)量同體重的小白鼠（同性或雌雄性各半），腹腔注射稀釋用生理鹽水或pH7.30.1磷酸鹽緩沖生理鹽水0.5ml作為對照。4注射后的小白鼠應(yīng)逐日觀察，并于喂食后2小時進行稱重。5于注射前、注射后72小時及7天，分別稱試驗組及時對照組小白鼠的體重。6試驗組小白鼠注射后7

17、2小時的總體重不少于注射前的總體重；7天小白鼠平均增加的體重不少于對照組平均增加體重的60%，并不得有死亡，該批原液毒性試驗判為合格。7試驗結(jié)果若達不到上述要求，可進行復(fù)試，仍達不到上述要求，原液可放置28保存34個月再進行復(fù)試，如仍達不到上述要求，該批原液的毒性判為不合格。吸附百日咳菌苗、白喉、破傷風(fēng)類毒素混合制劑使用說明書本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉類毒素及精制破傷風(fēng)類毒素用氫氧化鋁吸附制成。每ml中含百日咳菌8個效力單位，精制白喉類毒素20Lf、精制破傷風(fēng)類毒素5Lf。供兒童預(yù)防百日咳、白喉及破傷風(fēng)之日。本品為乳白色懸液，含硫柳汞防腐劑，放置后菌體易下沉，但經(jīng)振搖后能均勻分散。接種對象3個月6周歲兒童。用法1.臀部外上方1/4處或上臂外側(cè)三角肌附著處皮膚經(jīng)消毒后肌內(nèi)注射。2.免疫程序與劑量自3月齡開始免疫，至12月齡完成三針次免疫，每針間隔46周。1824月齡注射第4針。每次