悅肝膠囊對酒精中毒小鼠肝臟保護作用的組化和生化研究(一)

1、悅肝膠囊對酒精中毒小鼠肝臟保護作用的組化和生化研究(一)    作者：樸麗花， 金政， 蔡英蘭， 李善花 【關(guān)鍵詞】 悅肝膠囊；,酒精性肝損傷；,組織化學；,生物化學摘要：目的：研究悅肝膠囊對酒精性肝損傷小鼠肝臟的保護作用。方法：KM種小鼠隨機分正常組、模型組(56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、東寶肝泰組(0.8 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、悅肝膠囊大劑量組(10 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、悅肝膠囊中劑量組(5 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14

2、m1?kg-1?d-1)、悅肝膠囊小劑量組(2.5 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、連續(xù)灌胃6周,眼球采血，進行生化測定丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)；取出肝左葉按組織化學方法觀察琥珀酸脫氫酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)活性，油紅O法顯示中性脂肪。結(jié)果：悅肝膠囊可明顯抑制ALT活性巴(P0.05)，降低TG、MDA含量(P0.05)，提高SOD活性(P0.05)；組織化學觀察表明，損傷組SDH活性下降，ACP活性增高，脂滴增多。悅肝膠囊可減輕上述肝損傷程度。結(jié)論：悅肝膠囊對酒精中毒小鼠肝臟損傷有一定

3、的防治作用。關(guān)鍵詞：悅肝膠囊； 酒精性肝損傷； 組織化學； 生物化學據(jù)文獻報道1,酒精性肝病的發(fā)病率與酒精消耗平行,飲酒量越大其發(fā)病率越高，酒精中毒對肝臟的損害較其它組織、器官更嚴重，悅肝膠囊主要由葛根、丹參、西洋參、麥冬等中藥組成。臨床資料表明此方具有改善肝炎患者癥狀、恢復肝功能、調(diào)節(jié)免疫功能的作用。為探討悅肝膠囊的作用機理本實驗觀察了悅肝膠囊對酒精所致的肝損傷小鼠血清氧自由基相關(guān)指標及其對肝細胞酶活性變化的影響。1 材料和方法1.1 實驗動物KM種雄性小鼠，體重為（20±2）g，延邊大學醫(yī)學院實驗動物科提供，于室溫1820 普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。動物合格證：SCXK200

4、2-2005。1.2 藥物與試劑悅肝膠囊由延邊大學長白山天然藥物研究中心提供。制備方法：葛根30 g,丹參30 g,麥冬20 g,西洋參20 g,加蒸餾水煮1 h后過濾，濾出液備用，把原藥再煮1 h后過濾，把第1次濾出液和第2次濾出液混合，濃縮成100 ml即得。實驗用酒為北京二鍋頭酒廠生產(chǎn)的56度二鍋頭白酒。東寶肝泰為中國通化東寶藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。ALT，TG試劑盒為中生北控生物科技有限公司產(chǎn)品。SOD，MDA試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。1.3 主要儀器日本OLYMPUS萬能顯微鏡，芬蘭MK-3酶標儀，德國ZKl5超低溫高速離心機，北京天地百年科技有限公司TD一2000真彩色病理

5、細胞顯微分析系統(tǒng)，美國Starlet221恒冷箱切片機。1.4 方法將60只KM種小鼠隨機分為正常組、酒精損傷組、東寶肝泰組、悅肝膠囊大劑量組、悅肝膠囊中劑量組、悅肝膠囊小劑量組。藥物對照組給予0.8 g/kg體重東寶肝泰，藥物組分別給予10，5，2.5 g/kg 體重悅肝膠囊，正常組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，30 min 后除正常組外其余組均給予56度二鍋頭白酒14 ml/kg體重灌胃。小鼠連續(xù)灌胃6周，于末次灌胃24h ，眼球采血，分離血清，用酶標儀測SOD活性和MDA含量；快速斷頭處死小鼠，取出肝左葉進行組織化學觀察。1.5 觀察指標ALT活性采用賴氏法；TG含量按酶比色法；血清SO

6、D活性按黃嘌呤氧化酶法；MDA含量按硫代巴比妥酸法。肝組織冰凍切片，切片厚約8 m，進行組織化學染色。亞鐵氰化鉀法顯示琥珀酸脫氫酶，Gomori法顯示酸性磷酸酶活性，油紅O法顯示中性脂肪，在萬能相差顯微鏡下觀察并拍片。1.6 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)以±s表示，應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。2 結(jié)果2.1 組織化學2.2 血清學改變見表12。表1 各組血清ALT，TG比較（略）與正常組比較，#P0.01，與損傷組比較*P0.01表2 各組血清SOD活性和MDA含量比較（略）與正常組比較，*P0.05，與模型組比較，#P0.053 討論酒精性肝病是由于長期大量飲酒所致的肝臟疾病。

7、現(xiàn)代醫(yī)學認為其可能的發(fā)病機制為機體的免疫反應異常，自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，生物膜的損傷，肝細胞代謝紊亂等2。在本實驗中觀察到酒精性肝損傷時肝血清內(nèi)ALT活性和TG含量有明顯變化，其酶活性和含量變化可反映酒精導致肝損傷的嚴重程度。酒精中毒引起的肝損傷與酒精的代謝產(chǎn)物乙醛的直接毒性有關(guān)34，乙醛可使肝細胞內(nèi)線粒體受損，而使肝細胞對脂肪的分解功能低下，此時機體可動員皮下脂肪組織的脂肪酸向肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，致使血清TG含量增高。本實驗結(jié)果表明：模型組與正常組、東寶肝泰組、悅肝膠囊組相比較血清TG含量均有顯著差異，P0.01；組織化學染色顯示損傷組肝細胞內(nèi)可見較多的桔紅色脂滴沉著，其余各組均見少量脂滴。說明悅

8、肝膠囊對肝臟脂質(zhì)代謝起到一定的調(diào)節(jié)作用，可能主要通過悅肝膠囊中的丹參促進了脂肪在肝中的氧化作用，從而降低了肝脂的含量5。ALT主要分布于線粒體內(nèi)，且其活性是肝細胞損害的敏感指標6。當肝組織發(fā)生損傷或炎癥時，因能量障礙而致細胞膜通透性增加，使肝細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶釋放入血引起血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高，并在一定程度上反映肝細胞壞死和損傷程度7。悅肝膠囊可明顯降低酒精所致肝損傷的ALT升高，具有恢復肝功能作用。 超氧化物歧化酶(SOD)作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能使超氧化物陰離子自由基變?yōu)檫^氧化氫和氧離子，從而減少脂質(zhì)過氧化反應，使機體細胞和組織免受損傷。當機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡時就會產(chǎn)生大量的自由基，最

9、終形成過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物之一是丙二醛(MDA)，因此通過測定MDA可以間接反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和損傷程度，可以說自由基所引起的脂質(zhì)過氧化反應仍是誘發(fā)酒精性肝損傷的重要原因之一8。酒精性肝損傷的組織損傷與SOD、MDA之間存在密切關(guān)系。本實驗結(jié)果表明：模型組與正常組、東寶肝泰組、悅肝膠囊組相比較SOD活性、MDA含量均有顯著差異，P0.05。說明酒精引起的肝損傷中有大量自由基產(chǎn)生，悅肝膠囊能使酒精性肝損傷小鼠肝血清SOD活性增強，抑制MDA活性，并使之含量降低，可能與方中西洋參的抗氧化作用有關(guān)9。陳子馨等10提出酶組織化學是在研究酒精性肝損傷中具有早期及特征性的指標，是必不可少的重要檢測手段。琥

10、珀酸脫氫酶(SDH)是在檸檬酸循環(huán)中，催化琥珀酸與延胡索酸之間反應的一種酶。它存在于所有有氧呼吸細胞的線粒體內(nèi)膜，是線粒體內(nèi)膜的標志酶。SDH活性的變化與線粒體損傷同時出現(xiàn)，與線粒體的數(shù)目平行升降。因此，SDH可代表線粒體能量代謝，SDH的活性變化可作為線粒體損傷程度檢測的敏感指標之一。酸性磷酸酶(ACP)主要存在于溶酶體內(nèi)，是溶酶體的標志酶，當溶酶體膜受損、膜的穩(wěn)定性降低時溶酶體膜的通透性增強，屏障作用減弱，致使ACP等水解酶滲入胞質(zhì)，酶活性增強11，一方面參與吞噬消化變性壞死結(jié)構(gòu)，另一方面水解正常細胞結(jié)構(gòu)，加速細胞變性壞死過程。本實驗在灌入酒精后，SDH活性明顯降低、ACP活性則明顯增強。

11、而悅肝膠囊卻能使SDH活性增強，抑制ACP活性。說明悅肝膠囊可能通過減輕線粒體損傷和保護溶酶體膜而對肝臟起到保護作用。其確切的機理有待于進一步研究。悅肝膠囊中的葛根12，13可健脾化濕，疏肝活血，生津解渴，增加腦及冠狀血管血流量的作用，是民間百姓解酒毒的常用藥；丹參解酒瀉毒，理氣運脾，活血化瘀，具有保肝降酶，減輕肝細胞變性壞死，為解酒保肝藥；西洋參、麥冬、五味子起到輔助解酒的作用，諸藥合用具有解酒醒脾、益氣養(yǎng)胃的功效。并通過促進肝臟脂質(zhì)代謝，制脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化酶活性，起到保肝作用。通過本實驗證明悅肝膠囊有明顯的保肝作用，為尋找有效的抗ALD的中藥制劑提供了實驗依據(jù)。參考文獻：1 高榮慧.

12、葛花湯治療酒精性肝損傷82例J.中國民間療法，1996，4(1)：3939.2 陳宏慈，吳 勇.中醫(yī)藥治療酒精性肝病的臨床與實驗研究概況J.湖北中醫(yī)雜志，2000，22(1)：5l53.3 楊獻英，邵振鴻，楊萬里.中藥清開靈注射液防治小鼠酒精中毒性肝損傷J.華人消化雜志，1998，6(10)：847849.4 大西久仁房.酒精與肝病J.日本醫(yī)學介紹，1997，8(1)：67.5 陳全壽，盧聚沛軟肝消水湯治療酒精性肝硬變腹水25例J.浙江中醫(yī)雜志，1995，30(4)：149149.6 田德錄，葉永安，楊慧民.中藥慢肝消治療酒精性肝痼的臨床研究J.華人消化雜志，1998，6(11)：945947.7 梁擴寰.肝臟病學，第1版M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1995:208208.8 河福金，賁長恩，王德福.小柴胡湯對大鼠酒精性肝損傷防護作用的組化和生化研究J.北京中醫(yī)藥大學學報，1997，20(1)：4547.9 馬春力，李福全，趙玉珍，等.西洋參莖葉皂甙對急性乙醇中毒大鼠肝損害的影響J.佳木斯醫(yī)學院學報，1992，15(6)：1818.10 陳子馨，王泰齡，趙靜波.酒精性大鼠肝損傷中酶組織化學反應