悅肝膠囊對酒精中毒小鼠肝臟保護(hù)作用的組化和生化研究(一)

1、悅肝膠囊對酒精中毒小鼠肝臟保護(hù)作用的組化和生化研究(一)    作者：樸麗花， 金政， 蔡英蘭， 李善花 【關(guān)鍵詞】 悅肝膠囊；,酒精性肝損傷；,組織化學(xué)；,生物化學(xué)摘要：目的：研究悅肝膠囊對酒精性肝損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用。方法：KM種小鼠隨機(jī)分正常組、模型組(56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、東寶肝泰組(0.8 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、悅肝膠囊大劑量組(10 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、悅肝膠囊中劑量組(5 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14

2、m1?kg-1?d-1)、悅肝膠囊小劑量組(2.5 g?kg-1?d-1，56度二鍋頭白酒14 ml?kg-1?d-1)、連續(xù)灌胃6周,眼球采血，進(jìn)行生化測定丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)；取出肝左葉按組織化學(xué)方法觀察琥珀酸脫氫酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)活性，油紅O法顯示中性脂肪。結(jié)果：悅肝膠囊可明顯抑制ALT活性巴(P0.05)，降低TG、MDA含量(P0.05)，提高SOD活性(P0.05)；組織化學(xué)觀察表明，損傷組SDH活性下降，ACP活性增高，脂滴增多。悅肝膠囊可減輕上述肝損傷程度。結(jié)論：悅肝膠囊對酒精中毒小鼠肝臟損傷有一定

3、的防治作用。關(guān)鍵詞：悅肝膠囊； 酒精性肝損傷； 組織化學(xué)； 生物化學(xué)據(jù)文獻(xiàn)報道1,酒精性肝病的發(fā)病率與酒精消耗平行,飲酒量越大其發(fā)病率越高，酒精中毒對肝臟的損害較其它組織、器官更嚴(yán)重，悅肝膠囊主要由葛根、丹參、西洋參、麥冬等中藥組成。臨床資料表明此方具有改善肝炎患者癥狀、恢復(fù)肝功能、調(diào)節(jié)免疫功能的作用。為探討悅肝膠囊的作用機(jī)理本實(shí)驗(yàn)觀察了悅肝膠囊對酒精所致的肝損傷小鼠血清氧自由基相關(guān)指標(biāo)及其對肝細(xì)胞酶活性變化的影響。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)動物KM種雄性小鼠，體重為（20±2）g，延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物科提供，于室溫1820 普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。動物合格證：SCXK200

4、2-2005。1.2 藥物與試劑悅肝膠囊由延邊大學(xué)長白山天然藥物研究中心提供。制備方法：葛根30 g,丹參30 g,麥冬20 g,西洋參20 g,加蒸餾水煮1 h后過濾，濾出液備用，把原藥再煮1 h后過濾，把第1次濾出液和第2次濾出液混合，濃縮成100 ml即得。實(shí)驗(yàn)用酒為北京二鍋頭酒廠生產(chǎn)的56度二鍋頭白酒。東寶肝泰為中國通化東寶藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。ALT，TG試劑盒為中生北控生物科技有限公司產(chǎn)品。SOD，MDA試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。1.3 主要儀器日本OLYMPUS萬能顯微鏡，芬蘭MK-3酶標(biāo)儀，德國ZKl5超低溫高速離心機(jī)，北京天地百年科技有限公司TD一2000真彩色病理

5、細(xì)胞顯微分析系統(tǒng)，美國Starlet221恒冷箱切片機(jī)。1.4 方法將60只KM種小鼠隨機(jī)分為正常組、酒精損傷組、東寶肝泰組、悅肝膠囊大劑量組、悅肝膠囊中劑量組、悅肝膠囊小劑量組。藥物對照組給予0.8 g/kg體重東寶肝泰，藥物組分別給予10，5，2.5 g/kg 體重悅肝膠囊，正常組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，30 min 后除正常組外其余組均給予56度二鍋頭白酒14 ml/kg體重灌胃。小鼠連續(xù)灌胃6周，于末次灌胃24h ，眼球采血，分離血清，用酶標(biāo)儀測SOD活性和MDA含量；快速斷頭處死小鼠，取出肝左葉進(jìn)行組織化學(xué)觀察。1.5 觀察指標(biāo)ALT活性采用賴氏法；TG含量按酶比色法；血清SO

6、D活性按黃嘌呤氧化酶法；MDA含量按硫代巴比妥酸法。肝組織冰凍切片，切片厚約8 m，進(jìn)行組織化學(xué)染色。亞鐵氰化鉀法顯示琥珀酸脫氫酶，Gomori法顯示酸性磷酸酶活性，油紅O法顯示中性脂肪，在萬能相差顯微鏡下觀察并拍片。1.6 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。2 結(jié)果2.1 組織化學(xué)2.2 血清學(xué)改變見表12。表1 各組血清ALT，TG比較（略）與正常組比較，#P0.01，與損傷組比較*P0.01表2 各組血清SOD活性和MDA含量比較（略）與正常組比較，*P0.05，與模型組比較，#P0.053 討論酒精性肝病是由于長期大量飲酒所致的肝臟疾病。

7、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其可能的發(fā)病機(jī)制為機(jī)體的免疫反應(yīng)異常，自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，生物膜的損傷，肝細(xì)胞代謝紊亂等2。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到酒精性肝損傷時肝血清內(nèi)ALT活性和TG含量有明顯變化，其酶活性和含量變化可反映酒精導(dǎo)致肝損傷的嚴(yán)重程度。酒精中毒引起的肝損傷與酒精的代謝產(chǎn)物乙醛的直接毒性有關(guān)34，乙醛可使肝細(xì)胞內(nèi)線粒體受損，而使肝細(xì)胞對脂肪的分解功能低下，此時機(jī)體可動員皮下脂肪組織的脂肪酸向肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，致使血清TG含量增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組與正常組、東寶肝泰組、悅肝膠囊組相比較血清TG含量均有顯著差異，P0.01；組織化學(xué)染色顯示損傷組肝細(xì)胞內(nèi)可見較多的桔紅色脂滴沉著，其余各組均見少量脂滴。說明悅

8、肝膠囊對肝臟脂質(zhì)代謝起到一定的調(diào)節(jié)作用，可能主要通過悅肝膠囊中的丹參促進(jìn)了脂肪在肝中的氧化作用，從而降低了肝脂的含量5。ALT主要分布于線粒體內(nèi)，且其活性是肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)6。當(dāng)肝組織發(fā)生損傷或炎癥時，因能量障礙而致細(xì)胞膜通透性增加，使肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶釋放入血引起血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高，并在一定程度上反映肝細(xì)胞壞死和損傷程度7。悅肝膠囊可明顯降低酒精所致肝損傷的ALT升高，具有恢復(fù)肝功能作用。 超氧化物歧化酶(SOD)作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能使超氧化物陰離子自由基變?yōu)檫^氧化氫和氧離子，從而減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使機(jī)體細(xì)胞和組織免受損傷。當(dāng)機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡時就會產(chǎn)生大量的自由基，最

9、終形成過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物之一是丙二醛(MDA)，因此通過測定MDA可以間接反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和損傷程度，可以說自由基所引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)仍是誘發(fā)酒精性肝損傷的重要原因之一8。酒精性肝損傷的組織損傷與SOD、MDA之間存在密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組與正常組、東寶肝泰組、悅肝膠囊組相比較SOD活性、MDA含量均有顯著差異，P0.05。說明酒精引起的肝損傷中有大量自由基產(chǎn)生，悅肝膠囊能使酒精性肝損傷小鼠肝血清SOD活性增強(qiáng)，抑制MDA活性，并使之含量降低，可能與方中西洋參的抗氧化作用有關(guān)9。陳子馨等10提出酶組織化學(xué)是在研究酒精性肝損傷中具有早期及特征性的指標(biāo)，是必不可少的重要檢測手段。琥

10、珀酸脫氫酶(SDH)是在檸檬酸循環(huán)中，催化琥珀酸與延胡索酸之間反應(yīng)的一種酶。它存在于所有有氧呼吸細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜，是線粒體內(nèi)膜的標(biāo)志酶。SDH活性的變化與線粒體損傷同時出現(xiàn)，與線粒體的數(shù)目平行升降。因此，SDH可代表線粒體能量代謝，SDH的活性變化可作為線粒體損傷程度檢測的敏感指標(biāo)之一。酸性磷酸酶(ACP)主要存在于溶酶體內(nèi)，是溶酶體的標(biāo)志酶，當(dāng)溶酶體膜受損、膜的穩(wěn)定性降低時溶酶體膜的通透性增強(qiáng)，屏障作用減弱，致使ACP等水解酶滲入胞質(zhì)，酶活性增強(qiáng)11，一方面參與吞噬消化變性壞死結(jié)構(gòu)，另一方面水解正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞變性壞死過程。本實(shí)驗(yàn)在灌入酒精后，SDH活性明顯降低、ACP活性則明顯增強(qiáng)。

11、而悅肝膠囊卻能使SDH活性增強(qiáng)，抑制ACP活性。說明悅肝膠囊可能通過減輕線粒體損傷和保護(hù)溶酶體膜而對肝臟起到保護(hù)作用。其確切的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。悅肝膠囊中的葛根12，13可健脾化濕，疏肝活血，生津解渴，增加腦及冠狀血管血流量的作用，是民間百姓解酒毒的常用藥；丹參解酒瀉毒，理氣運(yùn)脾，活血化瘀，具有保肝降酶，減輕肝細(xì)胞變性壞死，為解酒保肝藥；西洋參、麥冬、五味子起到輔助解酒的作用，諸藥合用具有解酒醒脾、益氣養(yǎng)胃的功效。并通過促進(jìn)肝臟脂質(zhì)代謝，制脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化酶活性，起到保肝作用。通過本實(shí)驗(yàn)證明悅肝膠囊有明顯的保肝作用，為尋找有效的抗ALD的中藥制劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1 高榮慧.

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