力生長因子在大腸桿菌中的表達(dá)及活性分析

1、生物工程學(xué)報(bào) Chin J Biotech 2008, July 25; 24(7): 1180-1185 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb © 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved力生長因子在大腸桿菌中的表達(dá)及活性分析張兵兵1,2, 江鵬1,2, 鮮成玉1,2, 李玉筱1,2, 李大軍1,2, 唐麗靈1,2, 王遠(yuǎn)亮1,21 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院, 重慶 4000302 重慶大學(xué)國家“985工程”生物材料與仿生工程研究

2、中心, 重慶 400030摘 要: MGF(Mechano-growth factor)是一種IGF-1變體形式, 研究發(fā)現(xiàn)該因子具有應(yīng)力敏感性, 并且具有促進(jìn)肌肉肥大、再生以及神經(jīng)損傷修復(fù)的功能。通過RT-PCR從拉伸刺激的人成骨細(xì)胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少對(duì)腸激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 將截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)質(zhì)粒, 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3), 在30oC培養(yǎng)下以可溶形式表達(dá)融合蛋白Trx/再對(duì)融合蛋白E

3、K酶切, rpHPLCdes(1-3)MGF, 采用離子交換層析和Ni2+金屬親和層析, 獲得純度95%以上的融合蛋白。分離獲得純度達(dá)98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE及質(zhì)譜分析蛋白分子量與理論值相符。生物活性實(shí)驗(yàn)顯示, 所制備的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更顯著的促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增值和遷移。關(guān)鍵詞: 胰島素樣生長因子-1, 力生長因子, 原核表達(dá), 增殖, 遷移Expression of Mechano-growth Factor in Escherichia coli and Activity AnalysisBingbing Zhang1,

4、2, Peng Jiang1,2, Chengyu Xian1,2, Yuxiao Li1,2, Dajun Li1,2, Liling Tang1,2, and Yuanliang Wang1,21 Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400030, China2 National “985 Projiect Programme” Research Center of Bioinspired Materials Science and Engineering, Chongqing University, Chongq

5、ing 400030, China Abstract: Mechano-growth factor (MGF) is one of IGF-1 isoforms. MGF is mechanosensitive and has important functions in muscle hypertrophy, regeneration and nerve injury recovery. In this study, MGF cDNA (330 bp) was cloned from stretched osteoblasts by RT-PCR. In order to avoid pro

6、lin residue inhibiting enterokinase cleavage, 9bp of MGF cDNA 5 end sequence was truncated by primer, then the obtained truncated MGF (des(1-3)MGF) cDNA (321 bp) was subcloned in pET32a(+) vector to construct a prokaryotic recombination expression plasmid. Trx/des(1-3)MGF fusion protein, existing in

7、 forms of solution, was expressed in transformed Escherichia coli strain BL21(DE3) by IPTG induction at 30oC. The supernatant of cell lysates was subjected to ion exchange chromatography and Ni2+ metal affinity chromatography, and the fusion protein was obtained with the purity over 95%. After the f

8、usion protein was cleaved by enterokinase, Trx and des(1-3)MGF was isolated by reverse-phase HPLC. Through these procedures, des(1-3) MGF was obtained with the purity of 98%. The protein molecular mass was conformity to the theoretical value by SDS-PAGE and mass spectrometry analysis. The purified d

9、es(1-3)MGF was incubated with MC3T3-E1 for cell proliferation and migration assays. The results show that des(1-3)MGF exhibited more facilitative effects on proliferation and migration of MC3T3-E1 than that of des(1-3)IGF-1.Keywords: insulin-like growth factor-1(IGF-1), mechano-growth factor (MGF),

10、prokaryotic expression, proliferation, migrationReceived: November 8, 2007; Accepted: January 18, 2008Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 30600130).Corresponding author: Yuanliang Wang. Tel: +86-23-65102509; E-mail: cqingzbb國家自然科學(xué)基金(No. 30600130)資助。張兵兵等: 力生長因子在大腸桿菌中的表

11、達(dá)及活性分析1181IGF-1是一種重要的生理調(diào)控因子, 在胚胎期和出生后的發(fā)育過程中具有重要作用, 同時(shí)在整個(gè)生命過程中它都通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡來影響各種組織的動(dòng)態(tài)平衡以及組織功能。在以往對(duì)IGF-1的研究中, 認(rèn)為它由肝臟產(chǎn)生, 是一種通過循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮功能的內(nèi)分泌型生長因子1。最近, 在受應(yīng)力刺激的肌肉、骨骼, 以及損傷的肌肉、神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)一種IGF-1變體在局部組織中高表達(dá), 該變體除了包含成熟IGF-1的全部序列外, 在羧基端(C端)多出40個(gè)氨基酸(Amino acid, aa)的延伸肽(E肽), 因?yàn)檫@種因子在肌肉中具有應(yīng)力刺激敏感性, 故命名為力生長因子(Mechan

12、o-growth factor, MGF)25。MGF以自分泌/旁分泌的方式發(fā)揮功能, 與鍛煉引起的肌肉肥大相關(guān), 具有治療肌肉萎縮或神經(jīng)損傷的潛MGF主要由發(fā)生應(yīng)激在價(jià)值, 因此受到廣泛關(guān)注6,7。反應(yīng)的局部組織表達(dá), 在體內(nèi)的半衰期短, 直接從動(dòng)物體內(nèi)獲取該因子較困難。通過基因工程制備重組蛋白, 是大量獲得該因子的有效途徑。長期以來, 胰島素和IGF-1在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達(dá)有大量研究, 并獲得成功9,108位點(diǎn)以及腸激酶(Enterokinase, EK)酶切位點(diǎn)(Asp)4-Lys, 在3 端引入翻譯終止密碼以及EcoR I位點(diǎn)。將構(gòu)建好的序列插入pET

13、32a(+)的BamH I與EcoR I之間, 獲得N端連接Trx融合配體的pET32a(+)/des(1-3)MGF重組質(zhì)粒, Trx與des(1-3) MGF之間有6His、EK酶切位點(diǎn)等序列連接。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化E. coli DH5進(jìn)行擴(kuò)增, 并通過酶切和測(cè)序鑒定。1.3 重組蛋白的表達(dá)鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株, 挑取陽性克隆接種到含100 u/mL Amp的 LB培養(yǎng)基(LA)中, 30oC, 150 r/min培養(yǎng)過夜作為種子液。搖瓶表達(dá)條件: 種子液1:20 (V/V)轉(zhuǎn)接到LA培養(yǎng)基，培養(yǎng)物在37oC, 250 r/min的條件下培養(yǎng), 通過檢測(cè)發(fā)

14、酵條OD600值控制細(xì)菌在對(duì)數(shù)生長期內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)。件: 種子液1:20 (V/V) 轉(zhuǎn)接到M9CA培養(yǎng)基中, 37oC培養(yǎng), 低溫誘導(dǎo), 溶氧50%, 氨水調(diào)節(jié)pH 7.0。補(bǔ)料流加液: 30% 葡萄糖、5%胰蛋白胨、3%酵母提取物、50%甘油。對(duì)不同誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)結(jié)束后, 將所有培養(yǎng)物收集, 4oC, 10 000 r/min離心10 min, 獲細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀在20oC和37oC反復(fù)凍融兩次, 然后1:10 (W/V) 重懸在 Buffer A (50 mmol/L Tris-HCL, pH 9.5, 5 mmol/L EDTA,0.2 mg/mL

15、Lysozyme)中, 37oC緩慢攪動(dòng)30 min, 再將獲得的粘稠物置于冰上分批進(jìn)行超聲破菌, 每次500 mL, 超聲功率50 W, 脈沖15 s, 間歇5 s, 共進(jìn)行50次。超聲至破菌溶液不再粘稠, 將溶液在4oC, 12 000 r/min離心15 min, 沉淀和上清分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。本研究以pET32a(+)質(zhì)粒作載體, 利用它提供的T7啟動(dòng)子, 以及Trx蛋白, 采用融合蛋白的表達(dá)策略獲得MGF類似物des(1-3)MGF。1 材料與方法1.1 材料pET32a(+)質(zhì)粒、 E. coli菌株BL21(DE3)均為Novagen (Madison, WI, USA

16、)產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR試劑、內(nèi)切酶、連接酶均購自TaKaRa (Dalian, China)。所有蛋白層析操作在AKTA explorer 100上進(jìn)行, 層析柱填料為Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden)產(chǎn)品。HPLC分析在Waters 600 (Waters, USA)上進(jìn)行, 質(zhì)譜分析用Agilent 1100 MSD SL (USA)型質(zhì)譜儀。Des(1-3)IGF-1和Enterokinase分別為Peninsula Laboratories和Sigma公司產(chǎn)品。MC3T3-E1購置中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫, Milicell-PCF培養(yǎng)小室

17、為Milicell公司產(chǎn)品。1.4 重組蛋白的純化將離心獲得的含Trx/des(1-3)MGF的上清溶液, 進(jìn)行陰離子交換層析, 層析柱Q Sepharose FF先用Buffer B (25 mmol/L Tris-HCL, pH 8.0)平衡, 上樣結(jié)束, 繼續(xù)用Buffer B復(fù)平衡去除非特異性結(jié)合蛋白, 結(jié)合蛋白用補(bǔ)加了0.3 mol/L NaCl的Buffer B洗脫。接著, 在蛋白洗脫液中補(bǔ)加30 mmol/L的咪唑, 加載Ni2+ Chelating Sepharose FF層析柱, 上樣前柱體經(jīng)Buffer C (25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 30 m

18、mol/L Imidazole, 0.3 mol/L NaCl)平衡, 上樣結(jié)束, 柱體用Buffer C再次平衡。牢固結(jié)合在層析柱上的目的蛋J1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建MGF cDNA序列(GenBank Accession No. AX147742)通過RT-PCR從拉伸刺激的成骨細(xì)胞中擴(kuò)增獲得5。再次通過PCR去除cDNA 5端9 bp的序列, 獲得des(1-3)MGF cDNA, 同時(shí)引入BamH I1182 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech July 25, 2008 Vol.24 No.7白用含咪唑的Buffer C梯度洗脫。含融合蛋白

19、的洗脫液, 在Buffer C中, 4oC, 透析12 h, 去除咪唑。純化得到的Trx/des(1-3)MGF凍干濃縮至濃度 5 mg/mL, 然后以下述條件進(jìn)行EK酶切: 2.5 mg融反應(yīng)合蛋白, 用酶0.1 u, 37oC, 緩慢攪動(dòng), 反應(yīng)3 h?；旌衔颒CL調(diào)節(jié)pH到3.0, 通過rpHPLC進(jìn)一步分離, 層析柱填料為Source 15 RPC。流動(dòng)相組成如下: H2O-0.1% CF3COOH (流動(dòng)相A), 80% CH3CN-0.1% CF3COOH (流動(dòng)相B)。rpHPLC制備獲得的des(1-3) MGF經(jīng)質(zhì)譜鑒定。(Fig. 1)。重組質(zhì)粒在DH-5菌株中擴(kuò)增, 提取

20、質(zhì)粒經(jīng)過酶切和測(cè)序鑒定(結(jié)果未顯示)。圖1 重組結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of recombination constructionDes(1-3)MGF was expressed as fusions to the C-terminus of Trx.The fusion construction has six histidines, an enterokinase recognition, cleavage site positioned at the N-terminusof des(1-3)MGF1.5 生物活性分析MTT法比較分析des(1-3)

21、MGF和des(1-3)IGF-1對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響11。細(xì)胞制成3×105個(gè)/mL的-MEM (含10%胎牛血清)懸液, 100 L/孔接種到96孔板, 培養(yǎng)12 h, 更換無血清的新鮮-MEM, 進(jìn)行血清饑餓12 h后加入含不同濃度des(1-3)MGF 和 des(1-3)IGF-1 (10、20、50、100 ng/mL)的-MEM, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, MTT法分析細(xì)胞量。通過Milicell-PCF遷移小室分析des(1-3)MGF2.2 重組蛋白的表達(dá)通過OD監(jiān)測(cè), 控制誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)位于細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長期內(nèi)。結(jié)果顯示, IPTG誘導(dǎo)后, 細(xì)胞的生長率明顯降低,

22、 搖瓶表達(dá), 溫控30oC誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h, 收獲菌體濕重約20 g/L, 破菌溶液經(jīng)SDS-PAGE分析, 在分子量標(biāo)準(zhǔn)31 kD附近有明顯的特異條帶產(chǎn)生, Trx/des(1-3)MGF融合蛋白的理論分子量為33 kD, 可初步確定該特異條帶即為融合蛋白, 約占細(xì)菌總蛋白的15%, 融合蛋白主要位于上清液中(Fig.2,。發(fā)酵罐發(fā)酵, 菌體產(chǎn)量約為120 g/L, 融合 對(duì)細(xì)胞遷移的影響11,12。在24孔板中加入含 Lane S)蛋白表達(dá)可溶, 約占細(xì)菌總蛋白的12%。通過對(duì)誘25 ng/mL des(1-3)MGF或des(1-3)IGF-1的無血清-MEM 300 L/孔, 然后將Mi

23、licell-PCF小室置于其中, 再將無血清的200 L細(xì)胞懸液接種在Milicell-PCF小室, 培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液, 棉簽清除濾膜上表面未遷移細(xì)胞, 遷移到下表面的細(xì)胞經(jīng)蘇木素染色, 顯微鏡下對(duì)每組實(shí)驗(yàn)取10個(gè)視野計(jì)數(shù), 然后取平均值, 比較細(xì)胞的遷移能力。導(dǎo)起始時(shí)間、IPTG濃度、溫度、誘導(dǎo)持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化, 確定最佳表達(dá)條件是: 菌種以1:20 (V/V)的密度接種, 37oC培養(yǎng), 搖瓶培養(yǎng)OD600達(dá)到0.6, 發(fā)酵罐OD600達(dá)到3開始誘導(dǎo), IPTG濃度為0.2 mmol/L, 誘導(dǎo)過程中溫度降低至30oC, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。2 結(jié)果2.1 pET32a(+)/de

24、s(1-3)MGF重組質(zhì)粒的構(gòu)建從拉伸刺激后的人成骨細(xì)胞中RT-PCR擴(kuò)增MGF cDNA (330 bp) 序列5, 再次設(shè)計(jì)引物, 在MGF基因序列的N端引入EcoR I位點(diǎn)和EK酶切位點(diǎn), 為了避免第2位脯氨酸對(duì)EK酶切的抑制作用pET System Manual, 去除5端9 bp的序列, 在3 端引入翻譯終止密碼, 以及BamH I位點(diǎn), 重組序列共計(jì)348 bp。構(gòu)建好的des(1-3)MGF重組序列克隆入pET32a(+)質(zhì)粒的BamH I與EcoR I之間, 使得des(1-3)MGF位于Trx蛋白的閱讀框內(nèi), 實(shí)現(xiàn)Trx/des(1-3)MGF融合表達(dá), 在des(1-3)M

25、GF的N端引入EK酶切位點(diǎn), 便于將Trx與des(1-3)MGF分離J圖2 重組蛋白表達(dá)、純化與酶切結(jié)果的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteinexpression, purification and EK cleavageM: molecular weight marker; P: pellet sample from the cell lysates; S: supernatant sample from the cell lysates; Q: fusion protein eluted from Q Seph

26、arose FF column; N, fusion protein purified by Ni2+ chelating Sepharose FF column; E: fusion protein cleaved by enterokinase張兵兵等: 力生長因子在大腸桿菌中的表達(dá)及活性分析11832.3 重組蛋白的純化與分子量鑒定對(duì)破菌上清液中的融合蛋白進(jìn)行三步層析操作。首先通過離子交換層析, Trx/ des(1-3)MGF融合蛋白的理論等電點(diǎn)(pI)為5.9, 蛋白溶液pH 8.0能使融合蛋白凈帶負(fù)電荷, 通過Q Sepharose FF強(qiáng)陰離子交換層析使目的蛋白的濃度提高到80%

27、 (Fig. 2 Lane Q)。第二步, 將第一步中的洗脫液加載Ni2+ Chelating Sepharose FF親和層析柱, 咪唑梯度洗脫,融合蛋白主要在80至120 mmol/L咪唑濃度之間被充分洗脫, 洗脫的蛋白純度可達(dá)95% (Fig. 2 Lane N)。純度達(dá)95%的融合蛋白透析除去咪唑, 按上述方法進(jìn)行EK酶切, 3 h即可將融合蛋白充分酶切, 酶切比例達(dá)到80% (Fig. 2 Lane E)。rpHPLC分離酶切混合物, 獲純度達(dá)到98%的des(1-3)MGF (Fig. 3a)。質(zhì)譜鑒定des(1-3)MGF的分子量為12123.25, 在誤差范圍內(nèi)與理論計(jì)算值12

28、123.77一致(Fig. 3b)。圖3 純化蛋白的HPLC與質(zhì)譜分析Fig. 3 HPLC and Mass spectrometry analysis of purified des(1-3)MGF(a)loading sample is the eluted fraction from Source 15 RPC column, 20 L sample be analyzed, the absorbance was monitored at 214nm, des(1-3)MGF absorbance peak were detected about 22.9 min, purity is

29、 98%. (b) mass spectrometry analysis of purified des(1-3)MGF.Mw=121232.4 des(1-3)MGF對(duì)MC3T3-E1增殖和遷移的影響MTT法分析細(xì)胞增殖, 結(jié)果顯示, 在10、20、 50 ng/mL的濃度范圍內(nèi), 與對(duì)照組相比des(1-3) MGF和des(1-3)IGF-1均能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01), des(1-3)MGF作用組與des(1-3)IGF-1作用組OD值相比較, 在3種濃度下前者分別是后者的1.6、1.7、1.3倍。在100 ng/mL的濃度下, 兩種生長因子對(duì)細(xì)胞的增殖作用均減弱, 其

30、中des(1-3)MGF組與對(duì)照組間沒有顯著差異(Fig. 4)。圖4 des(1-3)MGF和des(1-3)IGF-1對(duì)MC3T3-E1增殖的影響Fig. 4 Effect of des(1-3)MGF and des(1-3)IGF-1 onMC3T3-E1 proliferationThe result of MTT had shown, des(1-3)MGF significantly promoted MC3T3-E1 proliferation at concentrations 10, 20 and 50 ng/mL, but not 100 ng/mL. (P<0.0

31、1, comparisons were made between des(1-3)MGF and control (or des(1-3)IGF-1)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響通過穿過Milicell-PCF小室底部有孔膜的細(xì)胞數(shù)目來評(píng)價(jià)(Fig.5a)。實(shí)驗(yàn)中生長因子的濃度采用25 ng/mL是因?yàn)槲墨I(xiàn)報(bào)道該濃度的IGF-1具有明顯的促細(xì)胞遷移能力18。每組實(shí)驗(yàn)取10個(gè)不同的視野細(xì)胞計(jì)數(shù), 取平均值得: 對(duì)照組33個(gè), MGF組216個(gè), IGF-1組96個(gè)(Fig. 5b)。因此des(1-3)MGF組細(xì)胞遷移數(shù)分別是對(duì)照組的6.5J1184 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q

32、Chin J Biotech July 25, 2008 Vol.24 No.7倍, 是相同濃度des(1-3)IGF-1處理組的2.5倍。與des(1-3)MGF融合表達(dá)。MBP/des(1-3)MGF能實(shí)現(xiàn)高表達(dá), 但產(chǎn)物仍以包含體為主(數(shù)據(jù)未顯示)。Trx/des(1-3)MGF融合蛋白的表達(dá), 通過改變誘導(dǎo)溫度來調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)速度, 改變蛋白折疊的熱力學(xué)環(huán)境, 實(shí)現(xiàn)了融合蛋白可溶表達(dá)。pET32a(+)質(zhì)粒中, 在Trx序列之后有緊接著的6His標(biāo)簽, 利用His與Ni2+間的配位親和作用, 使得融合蛋白得到了有效純化。為了從融合蛋白中分離出目標(biāo)蛋白, 在des(1-3)MGF的N端設(shè)

33、計(jì)EK酶切位點(diǎn), 酶切位點(diǎn)鄰近的氨基酸殘基會(huì)對(duì)酶切效率產(chǎn)生影響, 尤其是緊隨其后的脯氨酸對(duì)酶切具有抑制作用。完整MGF的第二位脯氨酸可能表現(xiàn)出這種抑制作用, 因此有必要去除或突變。在哺乳動(dòng)物中存在一種N端缺少3個(gè)aa的截短型IGF-1 (des(1-3) IGF-1), 研究發(fā)現(xiàn)des(1-3)IGF-1具有比完整IGF-1更高的活性16,17。受到該現(xiàn)象的啟發(fā), 我們截去MGF N端3個(gè)aa, 在不降低MGF活性的前提下提高了酶切效率, 后續(xù)活性實(shí)驗(yàn)顯示這種截短型MGF具有非常高的促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的活性。目前對(duì)MGF功能的研究顯示, MGF能夠明顯的促進(jìn)應(yīng)力損傷后的肌肉再生, 并認(rèn)為這種功

34、能是由于MGF激活了肌肉內(nèi)處于靜息狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖, 并且促進(jìn)細(xì)胞遷移, 從而參與肌纖維融合完體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn), 比較MGF成再生修復(fù)8,18。和IGF-1轉(zhuǎn)染的C2C12成肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn), MGF能促進(jìn)該細(xì)胞增殖抑制分化, 而IGF-1具有促進(jìn)分化的作用19, 同時(shí)Philippe等的實(shí)驗(yàn)顯示MGF的C端E肽具有促進(jìn)C2C12細(xì)胞遷移的功能12。以往的實(shí)驗(yàn)使我們認(rèn)為MGF也可能與應(yīng)力刺激下骨密質(zhì)的增加有關(guān)5, 本實(shí)驗(yàn)中利用成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1, 研究所制備的des(1-3)MGF可能的生物活性。增殖實(shí)驗(yàn)顯示, 我們所制備的des(1-3)MGF在一定的濃度范圍內(nèi)比des(1-

35、3)IGF-1具有更高的促進(jìn)MC3T3-E1增殖的作用, 其中10、20 ng/mL的促進(jìn)作用最大, 在50、100 ng/mL的濃度下對(duì)細(xì)胞的增殖促進(jìn)能力減弱, 造成這種現(xiàn)象的原因, 一方面可能存在促細(xì)胞增殖的濃度閾值, 另一方面可能與樣品中存在某些細(xì)胞毒性物質(zhì)的濃度相應(yīng)提高有關(guān)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示, 25 ng/mL的des(1-3)MGF要比同濃度的des(1-3)IGF-1對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用更為明顯。目前對(duì)于MGF與IGF-1表現(xiàn)出來的功能差異,圖5 des(1-3)MGF和des(1-3)IGF-1對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞遷移的影響Fig. 5 Effect of des(1-3)MG

36、F and des(1-3)IGF-1 onMC3T3-E1 migration(a) migrated cells in one random microscopic field (×200), (b)average of 10 microscopic fields in each group3 討論MGF和IGF-1屬于胰島素家族成員, 原核表達(dá)胰島素取得了巨大成功, 已經(jīng)在臨床上廣泛用于糖尿病的治療, IGF-1與前胰島素有62%的同源性, 也是一種具有重要臨床價(jià)值的生長因子, 并有E. coli表達(dá)IGF-1成功的報(bào)道9,10。MGF是IGF-1的一種前體形式, 因其有望成為

37、治療肌肉萎縮和損傷修復(fù)MGF包含IGF-1的的新型藥物而倍受關(guān)注68,13,14。全部序列, 具有與IGF-1相同的二硫鍵配對(duì)方式, 區(qū)別在于MGF具有C端40個(gè)aa的E肽。IGF-1含有三對(duì)二硫鍵, 在E. coli的胞質(zhì)環(huán)境中很難形成正確的配對(duì), 因?yàn)殄e(cuò)配幾率高, 體外復(fù)性IGF-1包含體較困難, 以往的研究顯示包含體IGF-1的復(fù)性率最多只有50%10, 15。因?yàn)镸GF與IGF-1有70個(gè)aa一致的序列, 我們推測(cè)MGF也面臨E. coli表達(dá)無活性的問題。將目的蛋白與可溶性好的蛋白融合表達(dá)是提高蛋白可溶性的有效策略, 我們分別采用pMAL-c2x和pET32a(+)兩種質(zhì)粒構(gòu)建des

38、(1-3)MGF融合表達(dá)系統(tǒng), 前者實(shí)現(xiàn)麥芽糖綁定蛋白(MBP)和des(1-3)MGF的融合表達(dá), 后者是硫氧還蛋白(Trx)J張兵兵等: 力生長因子在大腸桿菌中的表達(dá)及活性分析232238.1185主要認(rèn)為是由于MGF的C端E肽所致, 并認(rèn)為細(xì)胞表面存在一種E肽的特殊受體, 因此MGF可能不通過IGF-1R進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 而是存在獨(dú)立的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 并且MGF通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中纖維蛋白溶解系統(tǒng)和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移12,19。上述實(shí)驗(yàn)表明, 我們通過原核表達(dá)的MGF類似物des(1-3)MGF具備相應(yīng)的生物活性, 這將有助于對(duì)MGF進(jìn)行更深入的結(jié)構(gòu)和功能研究。9 Kim SO

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