高效液相色譜儀操作步驟

1、高效液相色譜儀操作步驟：1) 過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜(0.45um)。2) 對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。3) 打開HPLC工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。4) 進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。5) 有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10 ml/min。6) 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊in

2、jure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。7) 設計走樣方法。點擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。8) 進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等

3、。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。9) 關機時，先關計算機，再關液相色譜。10) 填寫登記本，由負責人簽字。注意事項：1) 流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。2) 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。3) 所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。4) 壓力不能太大，最好不要超過2000 psi。 液相色譜法簡介【我要發(fā)表論文】- 作者： dujinx 正文 氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結果，而必須由已知標準作對照定性。當無純物質(zhì)對照時，定性鑒定就很困難，這時需借助質(zhì)譜、紅外和化學法等配合。另外大多數(shù)金屬

4、鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。 在經(jīng)典液相色譜的基礎上，引入了氣相色譜的理論與技術，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個樣品往往長達幾小時至幾十小時，因此工作效率很低。人們曾對這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時間，但是結果失敗了。根據(jù)液相色譜理論，因為隨著載液（流動相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會顯著降低。隨著生產(chǎn)技術的提高，人們制成了細?。?lt;10m）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高

5、壓；輸液泵，使流速達到110mL/min。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術和計算機技術的應用，70年代以業(yè)逐步實現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜，以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。 高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。 高效液相色譜所用基本概念：保留值等色譜分析有關術語，以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用

6、基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率議程H=A+B/+C。式中：縱向擴散項（分子擴散項）B/對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組分分子在流動相中的擴散系數(shù)Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略不計。于是影響液相色譜的主要因素是傳質(zhì)項Cu。由圖14可知，氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色 譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權數(shù)種，其性質(zhì)差別也不大，對分離效果影響也不大。而液

7、相色譜的載液種類多，性質(zhì)差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要，并且在選擇流動相對應注意以下幾點：流動相對樣品有適當?shù)娜芙舛?，但不與樣品發(fā)生化學反應，也不與固定液互溶；流動相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進雜質(zhì)和組分在流動相中擴散系數(shù)下降；流動相應與所用檢測器相匹配，不應對組分檢測產(chǎn)生干擾作用。 高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點，還由于它的流動相（載液）種類比氣相色譜的流動相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相，從機時可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結構提供純樣品。 由于高效液相色譜

8、法具有以上特點，它適于分離、分析沸點高、熱穩(wěn)定性差、分子量大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質(zhì)占化合物總數(shù)的7580%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無機鹽類的分離和分析。 但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和易揮發(fā)物質(zhì)的分析方面也遠不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補短，相輔相成。 1分離原理 凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物

9、各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進行分離、分析的方法。 凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內(nèi)填充具有一定大小孔穴的凝膠。當樣品進入色譜柱后，不同大小的樣品分子（圖142中以黑點表示）隨流動相沿凝膠顆粒（圖142中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動相沖洗出來。中等體積的分子產(chǎn)生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個平衡過程而較晚地被流動相沖洗出來。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜

10、柱，從而實現(xiàn)分離目的。 光凝膠色譜采用水溶液作流動相進，稱為過濾凝膠色譜（HFC），而用有機溶劑為流動相時，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。 2固定相 凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立柱網(wǎng)狀結構的多聚體。 根據(jù)凝膠的交聯(lián)程度和含水量的不同，分了軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用于高壓（使用壓力低于2或更低），主要用于含水體系的常壓凝膠色譜，半硬質(zhì)凝膠（如苯乙烯一二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠），容量中等，滲透性較高，壓力可用到70kg/2。適用于非水溶劑流動相；硬質(zhì)凝膠（如多

11、孔硅膠、多也玻球等），膨脹度小，不可壓縮，滲透性好，可耐高壓，適于高流速下操作。 3流動相 在凝膠色譜中，為提高分率效率，多采用低粘度、與樣品折光指數(shù)相差大的流動相。常用的流動相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。 島津液相色譜儀注意事項【我要發(fā)表論文】- 作者： 孔桂昌 正文 1.流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用或更細的膜過濾)。2.流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。3.不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液。4.使用緩沖溶液時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然 后

12、用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。5.長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相(如甲醇等)，因為純水易長霉。6.每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器。柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。8.堵塞導致壓力太大，按預柱混合器中的過濾器管路過濾器單向閥檢查 并清洗。清洗方法；以異丙醇作溶劑沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清 洗；用10稀硝酸清洗。9.氣泡會致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。10.如果進液管內(nèi)不進液體時，要使用注射器吸液：通常在

13、輸液前要進行流動相 的清洗。11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。12.更換流動相時應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然后插入新的 流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。以上是我參考了相關資料，并結合在安裝使用液相色譜儀中的經(jīng)驗得出的，可能存在某些片面性，如有不當之處請多提寶貴建議。 島津LC_10ATvp液相色譜儀的故障現(xiàn)象及處理措施現(xiàn) 象主要原因措 施輸液不穩(wěn)定泵的脈流大1。泵頭內(nèi)進入氣泡。按pump ，驅(qū)出氣泡。排液管連接口連接注射器抽出氣泡。2。泵頭內(nèi)存有以前的流動相。按 pump ，將舊流動相完全清洗出去3吸濾器的管內(nèi)進入氣泡。按

14、 pump ，將舊流動相完全清洗出去。震動吸濾器，驅(qū)出氣泡。吸濾器網(wǎng)眼堵塞時，用超聲濾清洗。超聲濾清洗無效時，需更換。(檢查吸濾器網(wǎng)眼堵塞的方法 取出過濾部分，記錄壓力波形。 如果取出后壓力波形不正常，則吸濾器網(wǎng)眼堵塞。 )對流動相脫氣。4。單向閥工作不正常輸送異丙醇，清洗單向閥。清洗無效時，用超聲波清洗單向閥，或更換單向閥.5泵頭與泵頭座之間的縫隙，或清洗液出口漏液更換柱塞密封圈。更換柱塞密封圈后仍漏液時，更換柱塞。6流路的連接處漏液用力擰緊公螺母。擰緊后仍漏液時，更換公螺母和箍環(huán)。7流路堵塞，或?qū)⒁氯?。管道過濾器用超聲波清洗，或更換過濾器。找出堵塞的部件，更換新部件。8。柱塞密封圈的使用壽命將到極限更換柱塞。流量比設定值小1單向閥工作不正常。輸送異丙醇，清洗單向閥清洗后仍無效時，用超聲波清洗單向閥，或更換單向閥。2吸濾器網(wǎng)眼堵塞。(*2) 用超聲波清洗吸濾器。超聲波清洗無效時，更換吸濾器。保留時間的再現(xiàn)性不良1單向閥工作不正常。清洗仍無效時，更換單向閥，或用超聲波清洗。高壓梯度時2臺輸液泵的壓力表示不一致(相差在±05MPa(5kSfcm2)或±2以內(nèi)屬于正常)1壓力傳感