中藥化學和天然藥物化學實驗講稿

1、防己中生物堿的提取、分離與鑒定適用對象藥學、藥劑、環(huán)境、中藥、中藥國際交流、中藥知識產權、中藥制藥工程、中藥資源專業(yè)實驗學時24一、實驗目的學習生物堿類成分的一般提取分離法，通過實驗要求：（1）掌握生物堿的溶劑提取法和粉防己堿與防己諾林堿的分離方法。（2）熟悉生物堿的一般理化性質。（3）熟悉粉防己堿和防己諾林堿的檢識方法。（4）掌握回流法、萃取法、結晶法等的基本操作過程及注意事項。二、實驗原理本實驗是根據粉防己堿和防己諾林堿游離時難溶于水，易溶于氯仿，成鹽后易溶于水，難溶于氯仿的性質提取得到總生物堿。再利用兩者在冷苯中的溶解度不同，使之相互分離。三、儀器設備（單口，雙口）圓底燒瓶，冷凝管，鐵架

2、臺，分液漏斗，三角燒瓶，濾紙，微量抽濾器，布氏漏斗，層析槽，毛細管等。四、相關知識點防己為防己科植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根?？偵飰A含量約為1.52.3%，主要為粉防己堿和防己諾林堿。1、粉防己堿（tetrandrine），又稱漢防己甲素，分子式C38H42N2O6，在防己中的含量約為1%，為無色針狀結晶（乙醚），mp.217218。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿，溶于乙醚、苯等有機溶劑，幾乎不溶于水和石油醚。粉防己堿 R=CH3防己諾林堿 R=H 2、防己諾林堿（fangchinoline），又稱漢防己乙素，分子式C37H40N2O6，在防己中的含

3、量約為0.5%，六面體粒狀結晶（丙酮），mp.237238。溶解度與粉防己堿相似，但因較粉防己堿多一個酚羥基，故極性較粉防己堿稍大，因此在冷苯中的溶解度小于粉防己堿，可利用此性質相互分離。五、實驗步驟（一）總生物堿的提取稱取粉防己粗粉150克，置1000ml圓底燒瓶中，加95%乙醇以浸透并蓋沒生藥為度（約需400ml）。水浴加熱回流1小時（加熱期間振搖數次），濾出提取液，藥渣再加95%乙醇以浸沒為度（約需300ml），如上法再熱提一次，濾出提取液，最后將瓶內藥渣倒在布氏漏斗上抽濾壓干，藥渣棄去。合并兩次乙醇提取液，放冷后如有絮狀物析出，再抽濾一次，澄清液回收乙醇，濃縮至糖漿狀無乙醇味為止，得乙

4、醇總提取物。（二）生物堿的分離1、親脂性生物堿和親水性生物堿的分離糖漿狀總提取物移至大三角燒瓶中，逐漸加入1%鹽酸稀釋，充分攪拌使生物堿溶解，不溶物呈樹脂狀析出，直至加酸水溶液不再發(fā)生混濁為止（約需300ml），靜置，傾出上清液，瓶底的樹脂狀雜質以1%鹽酸少量分次洗滌，直至洗液對生物堿沉淀試劑反應微弱時為止。合并洗液和濾液，靜置片刻，抽濾得澄清濾液，置1000ml三角燒瓶中，滴加濃氨水至PH9左右，此時親脂性叔胺堿游離析出（如有發(fā)熱現象，設法冷卻），待溶液冷后，移至1000ml的分液漏斗中，加氯仿150ml振搖萃取。分取氯仿層，氨堿性水溶液再以新鮮氯仿萃取數次，每次用氯仿100ml，直至氯仿抽

5、提液的生物堿反應微弱時止（檢查時取少量氯仿抽提液置表面皿上，待溶劑揮干，殘留物中加稀鹽酸數滴使溶解，再加生物堿沉淀試劑試之），合并氯仿液。此氯仿液中含親脂性叔胺堿，氯仿萃取過的氨堿性水溶液含親水性季銨堿。后者取出少量，加鹽酸酸化至PH45，滴加雷氏銨鹽飽和水溶液，觀察有無沉淀出現。2、親脂性堿中酚性和非酚性堿的分離氯仿萃取液合并約（300400ml）移至1000ml的分液漏斗中，以2%氫氧化鈉水溶液40ml一次，萃取2次，氯仿液再用水20ml一次，洗滌2次。分取氯仿層，加無水碳酸鉀脫水干燥，過濾，濾液常壓下回收氯仿。將氯仿全部蒸去，殘留溶劑去瓶塞后揮干，得粗總非酚性生物堿。2%氫氧化鈉提取液合

6、并后取出少量，加鹽酸酸化后進行生物堿反應。附注：防己諾林堿雖有酚羥基但不溶于氫氧化鈉水溶液中，因而和非酚性生物堿一起在氯仿層中。3、叔胺生物堿的純化在盛有非酚性生物堿的圓底燒瓶中，加丙酮加熱溶解，過濾，用熱丙酮洗滌濾紙，濾液、洗液合并，回收丙酮至適量，放冷，加塞靜置待結晶析出。析出完全后抽濾收集。母液再濃縮重復收集，尚可得結晶。合并數次結晶即為粉防己堿和防己諾林堿的混合物。4、粉防己堿和防己諾林堿的分離苯冷浸法：取上述結晶狀混合物堿稱重，置于50ml三角瓶中，加5倍量的苯冷浸，時時振搖，冷浸半小時后，過濾分開苯溶液和苯不溶物。苯溶液回收苯至盡，殘留物以丙酮重結晶，得細針狀結晶，為粉防己堿。 苯

7、不溶物待揮發(fā)去殘留的苯后，也用丙酮重結晶，可得粒狀結晶，為防己諾林堿。（三）生物堿的一般鑒定方法1、沉淀反應（1）碘化汞鉀試驗：取樣品的稀酸水溶液1ml，加碘化汞鉀試劑（Mayer氏試劑）12滴，出現白色或類白色沉淀者為陽性反應，表示有生物堿存在。（2）碘化鉍鉀試驗：取樣品的稀酸水溶液1ml，加碘化鉍鉀試劑（Dragendorff氏試劑）12滴，出現棕黃至棕紅色沉淀者為陽性反應，表示有生物堿存在。（3）碘碘化鉀試驗：取樣品的稀酸水溶液1ml，加碘碘化鉀試劑（Wangner氏試劑）12滴，生成褐色至暗褐色沉淀者為陽性反應，表示有生物堿存在。（4）雷氏銨鹽試驗：取樣品的稀酸水溶液（PH45）1ml

8、，加雷氏銨鹽試劑數滴，生成黃紅色沉淀者為陽性反應，表示有生物堿存在。（5）苦味酸試驗：取樣品的中性溶液1ml，加苦味酸的飽和水溶液12滴，生成黃色沉淀者為陽性反應，表示有生物堿存在。2、薄層色譜吸附劑：中性氧化鋁（級）干法制版樣品：（1）粉防己堿（2）防己諾林堿（3）總提取物（均以氯仿溶解）展開劑：氯仿丙酮苯（3：1：4）顯色劑：噴以改良碘化鉍鉀試劑（干法鋪板顯色時，要在溶劑未干前噴顯色劑，否則氧化鋁粉末易飛散，使薄層破壞）。（四）實驗流程），濾液 藥渣（棄去）回收（沸石）乙醇至無醇味（雷氏銨鹽試驗）水分2次洗滌，無水 （酚性堿）碳酸鉀干燥后，濾過 沉淀反應回收氯仿加丙酮30ml，加熱溶解，濾

9、過濃縮至適量，過夜析晶，抽濾加丙酮加熱溶解，趁熱過濾加丙酮加熱溶解，趁熱過濾濾液 濾液放置析晶，濾過，干燥放置析晶，濾過，干燥粉防己堿（針狀結晶） 防己諾林堿（粒狀結晶）六、實驗報告要求應包括原理描述、實驗流程、數據記錄、解決問題的能力、實驗結果、實驗效果及建議等。七、思考題1、粉防己堿和防己諾林堿在結構與性質上有何異同點？實驗過程中，應怎樣利用它們的共性及個性進行提取分離？請設計方案。2、分離水溶性與脂溶性生物堿的常用方法有哪些？3、從防己中分離脂溶性、水溶性堿，酚性、非酚性堿的依據是什么？4、萃取過程中怎樣防止和消除乳化？5、生物堿的沉淀反應應在什么條件下進行，為什么？八、實驗成績評定方法

10、本門實驗課程考核成績占課程總成績的30%，該實驗考核成績占實驗總成績的40%。考核分實驗預習、實驗過程操作、實驗報告等三個方面，成績計算為預習實驗占20%（包括原理描述、實驗流程）、實驗過程操作占40%（包括數據記錄、解決問題的能力）、實驗報告占40%（包括實驗結果、實驗效果）。槐花中黃酮類化合物提取、分離和鑒定適用對象藥學、環(huán)境、中藥專業(yè)實驗學時18一、實驗目的要求學習黃酮類化合物的提取、分離和檢識，通過實驗要求：（1）通過蕓香苷提取與精制，掌握沸水提取黃酮類化合物的原理和操作。（2）掌握由蕓香苷水解制取槲皮素的方法。（3）掌握黃酮苷和黃酮苷元的分離。（4）掌握黃酮類化合物的主要性質及黃酮苷

11、、苷元和糖部分的檢識方法。二、實驗原理由槐花中提取蕓香苷的方法很多，本實驗是根據蕓香苷在冷水和熱水中的溶解度差異的特性進行提取和精制，或根據蕓香苷分子中具有酚羥基，顯弱酸性，能與堿成鹽而增大溶解度，以堿水為溶劑煮沸提取，其提取液加酸酸化后則蕓香苷游離析出。三、儀器設備單口圓底燒瓶，冷凝管，鐵架臺，燒杯，電爐，烘箱，水浴鍋，三角燒瓶，濾紙，微量抽濾器，布氏漏斗，試管，層析槽，石棉網，毛細管等。四、相關知識點槐花為豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，主要含蕓香苷（蘆?。?，含量高達1220%，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖。蕓香苷（rutoside），分子式C27H30O

12、16，分子量610.51，淡黃色針狀結晶，mp.177178。難溶于冷水（1：8000），略溶于熱水（1：200），溶于熱甲醇（1：7），冷甲醇（1：100），熱乙醇（1：30），冷乙醇（1：650），難溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀堿液中。槲皮素（quercetin），分子式C15H10O7，分子量302.23，黃色針狀結晶，mp.314（分解）。溶于熱乙醇（1：23），冷乙醇（1：300），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，幾不溶于水。HOOOHOH蕓香苷 R= 葡萄糖鼠李糖槲皮素 R=H五、實驗步驟（一）蕓香苷

13、的提取（水提取法）稱取槐花米50克，置1000ml燒杯中，加沸水800ml，加熱保持微沸1小時趁熱用棉花過濾，濾渣再加600ml水煮沸1小時，趁熱過濾，合并2次濾液放置過夜，析出大量淡黃色沉淀，抽濾，沉淀用水洗34次，抽干置于空氣中干燥即得粗蕓香苷，稱重計算得率。（二）蕓香苷的水解稱取蕓香苷粗品2克，盡量研細，投入500ml圓底燒瓶中，加2%H2SO4溶液150ml，接上冷凝管，直火加熱煮沸1.5小時，濾取沉淀物（即苷元槲皮素），濾液保留以鑒定糖部分，槲皮素沉淀經水洗滌抽干，自然干燥，稱重并計算水解得率。（三）蕓香苷、槲皮素重結晶稱取蕓香苷粗品2克，加甲醇50ml，加熱溶解，趁熱過濾，濾液濃縮

14、一半， 6放置析晶，過濾。濾液適當濃縮后放置，復析出結晶，濾取結晶。必要時結晶再用甲醇重結晶一次。取槲皮素全部，加適量95%乙醇，同上法重結晶一次。（四）蕓香苷、槲皮素和糖的紙色譜鑒定1、點樣：取新華一號色譜濾紙，規(guī)格20cm×20cm，在濾紙下端約2cm處用鉛筆畫一直線，間隔2cm分別點上下列樣品或標準溶液：（1）糖樣品溶液 （2）標準葡萄糖溶液（3）標準鼠李糖溶液 （4）蕓香苷樣品甲醇溶液（5）蕓香苷標準品溶液 （6）槲皮素樣品甲醇溶液（7）槲皮素標準品溶液2、展開劑：正丁醇-醋酸-水（4：1：5）上層上行展開。3、顯色：展開完畢，將濾紙取出，記錄溶劑前沿位置。待溶劑揮盡后，在（

15、3）與（4）點之間剪開，分別顯色。（1）糖的顯色：噴苯胺-鄰苯二甲酸試劑，在105烘10分鐘，顯棕色斑點。計算并比較樣品和標準品的Rf值。（2）黃酮化合物的顯色：可見光下觀察色斑，紫外燈下觀察熒光斑點。經氨氣熏后再觀察。待氨氣揮盡后，噴1%AlCl3甲醇溶液，再觀察。計算并比較樣品與標準品的Rf值。（五）蕓香苷和槲皮素性質試驗1、酸性試驗：取小試管8支，每4支一組，第一組每管中加入蕓香苷1mg，第二組每管中加入槲皮素1mg，每組四管中分別加入稀氨水、5%碳酸氫鈉水溶液、5%碳酸鈉水溶液、1%氫氧化鈉水溶液各2ml，振搖后觀察各管溶解情況。溶解的溶液應呈黃色。再加濃鹽酸數滴酸化，黃色褪去或變淺，

16、并有沉淀析出或產生渾濁。2、Molish反應：取試樣1mg置小試管中，加乙醇0.5ml溶解，加-萘酚試劑12滴，搖勻。傾斜試管，沿管壁徐徐注入濃硫酸約0.5ml靜置。觀察兩層溶液的界面變化，出現紫色環(huán)者為陽性，表示樣品分子中含有糖的結構（糖和苷類均呈陽性反應），比較蕓香苷和槲皮素的不同。3、Fehling試驗：取試樣數mg，溶于0.5ml熱水中，加斐林氏試劑甲、乙等量 7混合液2ml，沸水浴上加熱，如產生氧化亞銅的暗紅色或黃色沉淀表示有還原糖或其它還原性物質。充分加熱作用后濾去沉淀，濾液滴加濃鹽酸酸化，在水浴上加熱水解，水解液以10% NaOH中和，再進行斐林氏試驗，此時顯陽性反應者表示樣品為

17、糖苷化合物。比較蕓香苷和槲皮素的不同。4、鹽酸-鎂粉反應：取蕓香苷1mg，加乙醇2ml，在水浴上加熱溶解，加鎂粉約50mg，滴加數滴濃鹽酸，溶液由黃色漸變紅色者表示有黃酮類化合物。以同法試驗槲皮素。如用鋅粉代替鎂粉，則蕓香苷（3-羥基與糖結合成苷）仍有作用，而槲皮素（黃酮醇類）不呈還原顯色反應。因此可區(qū)別兩者。5、鋯-檸檬酸反應：取樣品1mg，加乙醇2ml，在水浴上加熱溶解，再加2%二氯氧鋯甲醇溶液34滴，凡有3-羥基或5-羥基的黃酮即呈鮮黃色。然后加2%檸檬酸甲醇溶液34滴，有3-羥基的黃酮黃色不褪。比較蕓香苷和槲皮素的不同。6、三氯化鋁反應：取樣品1mg溶于甲醇中，加1%三氯化鋁甲醇溶液2

18、3滴，黃酮類呈鮮黃色，并有熒光。（六）實驗流程槐花米50g2g蕓香苷粗品 甲醇重結晶 2%硫酸，放冷抽濾精制蕓香苷濾液（糖類） 沉淀（苷元）95%乙醇重結晶鑒定反應 槲皮素精制品六、實驗報告要求應包括原理描述、實驗流程、數據記錄、解決問題的能力、實驗結果、實驗效果及建議等。七、思考題1、黃酮類化合物還有哪些提取方法？蕓香苷的提取還可用什么方法？2、酸水解常用什么酸？為什么用硫酸比用鹽酸水解后處理更方便？3、本實驗中各種色譜的原理是什么？解釋化合物結構與Rf值的關系。4、試討論苷類成分的檢識程序。八、實驗成績評定方法本門實驗課程考核成績占課程總成績的30%，該實驗考核成績占實驗總成績的40%?？?/p>

19、核分實驗預習、實驗過程操作、實驗報告等三個方面，其成績計算為預習實驗占20%（包括原理描述、實驗流程）、實驗過程操作占40%（包括數據記錄、解決問題的能力）、實驗報告占40%（包括實驗結果、實驗效果）?；被ㄖ悬S酮類化合物分離和鑒定適用對象中藥國際交流、中藥知識產權、中藥制藥工程、中藥資源專業(yè)實驗學時9一、實驗目的要求學習黃酮類化合物的提取、分離和檢識，通過實驗要求：（1）了解沸水提取黃酮類化合物的原理和操作。（2）了解由蕓香苷水解制取槲皮素的方法。（3）掌握黃酮類化合物的主要性質及黃酮苷、苷元和糖部分的檢識方法。二、實驗原理由槐花中提取蕓香苷的方法很多，本實驗是根據蕓香苷在冷水和熱水中的溶解度

20、差異的特性進行提取和精制。紙色譜的分離原理是利用各種化合物在流動相和固定相中分配系數的不同而達到分離目的。三、儀器設備烘箱，水浴鍋，鐵架臺，燒杯，三角燒瓶，濾紙，試管，層析槽，毛細管等。四、相關知識點槐花為豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，主要含蕓香苷（蘆 9?。?，含量高達1220%，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖。蕓香苷（rutoside），分子式C27H30O16，分子量610.51，淡黃色針狀結晶，mp.177178。難溶于冷水（1：8000），略溶于熱水（1：200），溶于熱甲醇（1：7），冷甲醇（1：100），熱乙醇（1：30），冷乙醇（1：650），難

21、溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀堿液中。槲皮素（quercetin），分子式C15H10O7，分子量302.23，黃色針狀結晶，mp.314（分解）。溶于熱乙醇（1：23），冷乙醇（1：300），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，幾不溶于水。HOOOHOH蕓香苷 R= 葡萄糖鼠李糖槲皮素 R=H五、實驗步驟（一）蕓香苷、槲皮素和糖的紙色譜鑒定1、點樣：取新華一號色譜濾紙，規(guī)格20cm×20cm，在濾紙下端約2cm處用鉛筆畫一直線，間隔2cm分別點上下列樣品或標準溶液：（1）糖樣品溶液 （2）標準葡萄糖溶液（3）標準鼠李糖溶液 （4）蕓香苷樣品甲醇溶液（5）蕓香苷標準品溶液 （6）槲皮素樣品甲醇溶液（7）槲皮素標準品溶液2、展開劑：正丁醇-